Еволуциони промени во употребата на редокс-активни аминокиселини и нивните причини - PDF Free
Еволуциони промени во употребата на редокс-активни аминокиселини и нивните причини Еволутивна варијабилност при употреба на RedoxActive аминокиселини: Причини и последици Д дисертација за добивање на степен доктор на природни науки на Биолошкиот факултет на Универзитетот Јоханес Гутенберг во Мајнц презентиран од Марио Шинделдекер роден на 20 декември 1978 година во ад. На Родалбен Родалб Мајнц, 2014 година
Декан: 1-ви рецензент: 2-ри рецензент: Ден на усно испитување: 3 јуни 2015 година
Содржина Список на кратенки. IV 1 Вовед. 1 1.1 Оксидативен стрес. 1 1.2 Митохондрија. 1 1.2.1 Структура и функција. 2 1.2.2 Митохондријален респираторен ланец и оксидативна фосфорилација. 4 1.2.3 Отстапувања од универзалниот генетски код. 11 1.3 Теорија на слободни радикали за стареење. 12 1.3.1 Реактивни видови кислород. 12 1.3.2 Митохондријална теорија на слободни радикали за стареење. 14 2 Прашања и цели. 17 3 материјал. 18 3.1 Евиденција на податоци за протеини. 18 3.1.1 Lивотен век, телесна маса и протеински низи на испитани животински видови. 18 3.1.2 Секвенци на човечки протеини на одделни оддели. 20 3.1.3 Нуклеарни и митохондријално кодирани подединици на комплексите на респираторниот ланец. 21 3.2 Компјутерски програми и софтверски пакети. 21 3.3 Специјални хемикалии. 21 3.4 Список на уреди. 22 3.5 Клеточна култура. 23 3.5.1 Клонални клетки. 23 3.5.2 Примарни клетки. 23 3.6 Медиуми и решенија за клеточна култура. 23 3.7 Решенија за биохемиски и клеточни биолошки анализи. 24 3.8 Бафери и раствори за анализа на протеини и липиди. 24 3.9 Антитела. 27 4 Методи. 29 4.1 Биоинформатички анализи. 29 4.1.1 Фреквенција на употреба на аминокиселини во протеинските низи. 29 4.1.2 Идентификација на мембранските области. 29 4.2 Клеточна култура. 29 4.2.1 Одредување на староста на клетките на клетките IMR90. 29 И.
Листа на кратенки 2SH меркаптоетанол 4SH 1-butanethiol 8SH 1-octanethiol 10SH 1-decanethiol 12SH 1-dodecanethiol 14SH 1-tetradecanethiol 18SH 1-octadecanethiol ABAM се меша антибиотик-антифунгални микс амонијачен ammonate, болка ацетилхолин естераза AA catalanethiol, болка, ацетилхолинестераза АА, болка, ацетилхолин triphase, болка, ацетилхолин triphase, болка, ацетилхолин triphase, болка, ацетилхолин triphase, болка, catalosulphase, болка, catalosulphase, болка, ацетилхолин triphase, болка, catalosulphase, болка, aacetylcholine triphase, болка, односно catalosulphase, A. каталаза КМТ цистеин ddH2O двојно дестилирана вода на модификуван медиум орел е DMS Dodecylmethylsulfid DMSO диметилсулфоксид ДНК 3-mercaptopropionic киселина DHA докозахексанонска киселина DMEM Dulbecco е деоксирибонуклеинска киселина DOH 1-dodecanol DPBS Dulbecco е фосфатен пуфер CstF стимулација на расцепување фактор DTT дитиотреитол EDTA етилендиаминтетраоцетна ER ендоплазматичниот ретикулум трансфер ЕТФ електрони прстен флавопротеин EtOH етанол FBS/FCS серумски фетални говеда/теле, серум кај фетални говеда FMN флавин мононуклеотид GRase глутатион редуктаза IV
GSH глутатион ГПХ глутатион пероксидаза ч часови, часови Х2О2 водород пероксид ХРП рен пероксидаза, рен пероксидаза МАМ митохондрија асоцирана мембрана ЕР мем НЕАА минимум есенцијален медиум, неесенцијални аминокиселини МТС митохондрија мингондријална таргетирање мин mtdna Митохондријална деоксирибонуклеинска киселина Msr метионин сулфоксид редуктаза МТТ 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолиум бромид MUFA (а) мононезаситена масна киселина (а), мононезаситена масна киселина (n) мм милиматолам мг NADPH никотинамид аденин динуклеотид фосфат NOX NADPH оксидаза NaN3 натриум азид nm нанометар Oxa1 митохондријална оксидаза собрание протеин 1 PAGE полиакриламид гел електрофореза ПД популација двојно PUFA (и) полинезаситена масна киселина (а), собна температура полинезаситена масна киселина (а), собна температура полинезаситена маст киселина (р) реактивен вид кислород, реактивен Са ustoffspies СДС натриум Додецил Сулфат, натриум Додецил Сулфат SOD супероксид дисмутаза SRP препознавање сигнал честичка V
t12sh терц-додеканетиол ТБАРС реактивни супстанции на тиобарбитурна киселина, реактивни супстанции на тиобарбитуринска киселина TEMED N, N, N ', N'-тетраметилетилендиамин ТФА транс масни киселини, транс масни киселини ТМ трансмембран ТОЦ α-токоферол, трансфекта на витамин Е ТОБ-мембранска киселина на ТБО транс-нуклеинска транс-метаболна киселина Тиоредоксин TWEEN полисорбат VDAC зависен од напон анјонски канал VI
Вовед Слика 5: Преглед на реакциите на реактивните кислородни видови и нитро видовите во митохондрионот и неговите последици. Адаптирано од Смит и сор., 2003 година. Токсичноста на супероксидот во митохондријалната матрица може да се изучува кај митохондријалните нокаут глувци Mn-SOD, кои преживеале само помеѓу 10 и 20 дена дури и во присуство на антиоксиданти (Лебовиц и сор., 1996; Ли и сор., 1995). Спротивно на тоа, нокаутот на цитозолен Cu/Zn-SOD не е смртоносен, иако овие животни покажуваат малку зголемена чувствителност на ROS (Ho et al., 1998), што сугерира дека екстрамитохондријалниот супероксид е помалку токсичен. Карактеристика на доживотната акумулација на протеини и липиди оштетени од оксидација е строго зависна од возраста појава на липофусцин, неразградливо складирање на липофилни, агрегирани протеини (30-58%) и липиди (1951%) во постмитотични клетки (Porta, 2002). Липофусцин се јавува особено силно во срцевиот мускул и нервните клетки, како и во епителот на пигментот на мрежницата. Сумирајќи, прогресивниот тек на стареење може да се објасни со помош на оваа теорија како што следува: Во текот на стареењето, оксидираните протеини постојано се акумулираат. Оксидацијата на 16
Материјал 5 ml пируват (100 mm) 5 ml MEM NEAA (100 mm) 3,7 Раствори за биохемиски и клеточни биолошки анализи Раствор на MTT (3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолиум бромид: 5 mg/ml MTT во раствор за растворање на ddh2o MTT: 40% (w/v) диметилформамид 10% (w/v) натриум Додецил сулфат pH 4,0 (глацијална оцетна киселина) 3,8 пуфери и раствори за анализа на протеини или липиди 10x сосолен раствор на фосфат (PBS): 1,37 M NaCl 27 mm KCl 100 mm Na2HPO4 x H2O 18 mm KH2PO4 ph 7,4 Фосфат-пуфер солен раствор со TWEEN-20 (PBS-T): 1x PBS 0,05% (v/v) TWEEN-20 ph 7.4 Тампон за берба на клетки (пуфер за лиза) без SDS: 24
Материјал 50 mm Tris-HCl 10% сахароза 1 mm EDTA 1 mm EGTA 15 mm HEPES 1 mm натриум ортованадат 1 mm NaF протеиназа инхибитор 1: 100 (Сигма-Олдрих) инхибитор на фосфатаза 1: 100 (Сигма-Олдрих) ph 6,8 4x пуфер за полнење (Тампон за примерок) за SDS-PAGE: 200 mm Tris-HCl, pH 6,8 8% (без напојување) SDS 40% (w/v) глицерол 0,02% (w/v) бромофенол сино 20% (v/v) тампон за трчање β-меркаптоетанол 10x за SDS-PAGE: 250 mm Tris база 2,5 M глицин 1% (без напон) SDS pH 8,3 одделувачки гел за SDS-PAGE: 0,375 M Tris-HCl, pH 8, 8 10% (без напон) акриламид/бисакриламид (29: 1) 0,1% (без напон) SDS 0,05% (напон/вол) ТЕМЕД 25
Материјал 0,1% (без напон) Гел за редење APS за SDS-PAGE: 0,15 M Tris-HCl, pH 6,8 3% (без напон) акриламид/бисакриламид (29: 1) 0,1% ( w/v) SDS 0,05% (v/v) TEMED 0,1% (w/v) APS 10x трансфер пуфер: 250 mm Tris база 2,5 M глицин Додавање 20% метанол во 1x разредување 1x Ponceau S.: 0,2% (без напон) Понсо S 5% (вон/в) пуфер за блокирање на оцетна киселина: 5% (без напојување) суво млеко во прав (без маснотии) во PBS-T Не-редуцирачки липиден пуфер (дегазиран): 20 mm TRIS, ph 7,4 1 mm MgCl2 5 mm KCl 26
Материјал пуфер за анализа на масни киселини: 1x PBS 10 μm фенотијазин 1 mm DTT 1 mm EDTA Луминол раствори за развој: А: 0,1 М Tris-HCl, pH 8,6 0,025% луминол Б: 0,11% пара-кумарна киселина во ДМСО С: 30% анализа на H2O2 TBARS Стоп за раствор: 5% трихлороцетна киселина во 1 М глацијална оцетна киселина 0,5% тиобарбитурна киселина во 10 mm NaOH 3,9 Антитела Користените антитела се разредуваат во PBS-T до концентрациите дадени подолу. Покрај тоа, на примарните антитела е додаден 0,05% натриум азид (NaN3). Производител на антитела анти-hsp70 (1: 1000) ген на стрес, САД анти-hsp90 (1: 1000) ген на стрес, САД anti-p21 (1: 500) BD Biosciences, САД anti-p53 (1: 1000) Abcam, USA anti-p62 (1: 500) Сао Круз биотехнологија, САД анти-полиубиквитин (1: 1000) Дако, Данска, анти-тубулин (1: 1000) Сигма-Олдрич, Германија Табела 6: Примарни антитела 27
Производител на антитела на материјал Esel anti-mouse-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Esel anti-rabbit-hrp (1: 10000) (Dianova) Jackson ImmunoResearch, USA Табела 7: Секундарни конјугати на антитела-HRP 28
Резултати Слика 7: Односи на распределбата на аминокиселините помеѓу пероксизомалните и клеточните протеини кај 4 вида (одлево надесно: Хомо сапиенс, Бос-бик, Мус мускукулус, Rattus norvegicus). 5.1.2 Споредба на митохондријалните и клеточните протеини Односот на употребата на аминокиселини во митохондријално кодирани протеини во споредба со клеточни протеини или митохондријално кодирани протеини во споредба со митохондријално локализирани протеини се користеше како модели два и три (слика 8 и слика 9). Некои особености на митохондрионот се дека тој се смета за главно место за производство на оксидативни кислородни видови (Бренд, 2010) и дека во митохондријално кодираните протеини на комплексот I, редостективниот цистеин од аминокиселина се исцрпува во зависност од животниот век (Шинделдекекер и сор., 2011), додека ова исто така, таму се збогатува редокс-активниот метионин без оглед на максималниот век на траење (Бендер и сор., 2008). Ова го прави митохондрионот истакнат модел на кој можат да се изучуваат еволутивните адаптации на оксидативниот стрес и добиената диференцирана фреквенција на употреба на аминокиселини. 39
Резултати Користете KLMNPQRSTVWY Аеробит (V) 1,39 1,01 1,51 1,16 1,63 1,77 1,04 0,93 1,68 0,58 1,03 0,68 5E-05 6E-01 2E -06 1E-02 5E-09 9E-12 2E-01 5E-05 1E-09 3E-12 6E-01 2E-11 Табела 12: Модел V: Фреквенција на употреба на аминокиселини во митохондријално кодирани протеини на респираторниот ланец во слободно живеење, аеробни наспроти паразитски, анаеробни хелминти. (еднонасочна, непараметарска анализа на варијанса со две категории). * Терминот рација го опишува односот на средните вредности. Ако се спореди диференцираната употреба на аминокиселини во митохондријално кодираните протеини на респираторниот ланец помеѓу аеробни и анаеробни црви, се забележува дека цистеинот покажува најголема просечна промена во формата на осиромашување (Табела 12). Сепак, најголемото значење го покажува хистидинот, што е резултат на малото расејување на податочните точки. Фреквенцијата на употреба на метионин, од друга страна, покажува голема расеаност во испитуваните животински видови, што, во комбинација со висока просечна девијација, обезбедува средно статистичко значење. Бидејќи дисперзијата на амино киселина валин е мала, тоа резултира со најзначајна промена во овој модел. 49
Резултати на подлога за оксидирање што ја инхибира или ја забавува оксидацијата на истата (Халивел, 1990). Треба да се напомене дека покрај супстанциите што можат да се оксидираат, аминокиселините можат да послужат и шеќер, ДНК и липиди. Особено е интересно што метионинот се акумулира во протеините на внатрешната митохондријална мембрана, што е биолошки предизвикано од присуството на два метионински кодони во митохондријално кодираните протеини на респираторниот ланец. Се претпоставува дека акумулацијата на метионин во овие протеини и поврзаното удвојување на метионинскиот кодон во митохондријалната ДНК, каузално се должи на производството и зголемената појава на ROS во овој органел или оддел (Бендер и сор. ., 2008). Затоа беше од интерес да се испита употребата на метионин во различни оддели или области на човечката клетка за да се утврди дали може да се најде тополошки специфична фреквенција при употребата на оваа аминокиселина. Како резултат, се анализираа секвенците на човечки протеини од различни подклеточни области за нивната содржина на метионин. 52
Резултати 5.2.1 Споредба на употребата на метионин во различни подклеточни области Слика 10: Употреба на метионин во човечки протеини во различни подклеточни области. Секоја вертикална линија симболизира единствен протеин, чија позиција одговара на рангот во употребата на метионин во кривата на дистрибуција прикажана подолу. Зелените линии се однесуваат на соодветниот просек, црвените линии за соодветната средна употреба на метионин во испитуваните оддели. Континуираната вертикална линија ја означува глобалната медијана на сите протеински низи испитани во 19806 година. Слика 10 ја покажува статистичката дистрибуција на метионин во човечки протеини во различни подклеточни области. Следните кратенки се користени на Слика 10 и во Табела 14 53
Резултати Споредбата на четирите комплекси на респираторни синџири I, III, IV и V, во кои под-единици доаѓаат и од јадрото и од самиот митохондрион, исто така, покажува различна фреквенција на употреба на метионин. Во просек, комплексот I се состои од 5,84% метионин кај сите испитани животински видови, 2,64% кај животни со еден Met кодон и 6,82% метионин кај животни со два Met кодони; Комплекс III кај сите од 3,79% метионин, кај животни со еден Met кодон од 2,30% и кај животни со два Met кодони од 4,24% метионин. Комплекс IV кај сите од 4,72%, кај животни со еден Met кодон од 3,42% и кај животни со два Met кодони од 5,11% метионин; Комплекс V кај сите животински видови од 5,31%, кај животни со еден Met кодон од 3,17% и кај животни со два Met кодони од 5,97% метионин. Најголемата разлика во рамките на различните комплекси може да се забележи во комплексот И. Постои разлика во фреквенцијата на употреба на метионин од 4,18% помеѓу животните со еден Met кодон и животните со два Met кодони. 60
Резултати Слика 12: Стапка на преживување на HT22 клетките по инкубација со 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm и 200 μm CAM, DES, CYS и GSH за 72 часа (n> = 3). Супстанциите растворливи во вода CAM, DES, CYS и GSH употребени на слика 12 не покажуваат токсичен ефект врз HT22 клетките на која било од концентрациите што се користат по инкубацијата за 72 часа. Слика 13: Стапка на преживување на HT22 клетките по инкубација со 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm и 200 μm 2SH, 4SH, 8SH и 12SH за 72 часа (n> = 3). По инкубација на клетките HT22 со липофилните супстанции 2SH, 4SH, 8SH и 12SH за 72 часа, пронајдена е диференцирана токсичност. Со зголемување на концентрацијата, токсичноста на сите супстанции се зголемува. Токсичниот ефект е најизразен со 12SH, потоа со 8SH, 4SH и 2SH. Токсичноста на тој начин е во корелација со должината на алкилскиот ланец и концентрацијата на 62
Резултати, концентрацијата не влијае на токсичниот ефект. Само CAM покажа ниска токсичност зависна од концентрација по 72 часа. Слика 15: Преживување на клетките на IMR90 клетките (PD 28.1) по 72 часа инкубација со 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm и 200 μm 2SH, 4SH и 8SH (n> = 3 ) По 72 часа третман на клетките IMR90 со сè повеќе липофилните супстанции 2SH, 4SH и 8SH, имаше и мала токсичност (Слика 15). Ниту една од трите применети супстанции не покажа јасни ефекти зависни од дозата. Слика 16: Стапка на преживување на IMR90 клетките (PD 28.1) по 72 часа инкубација со 1 μm, 2 μm, 5 μm, 10 μm, 20 μm, 50 μm, 100 μm и 200 μm 10SH, 12SH, 14SH (n> = 3 ) Стапката на преживување на IMR90 клетките третирани со 10SH, 12SH и 14SH за 72 часа се зголеми за 64