Ин витро и ин виво анализа на антиканцерогената активност на куркумин и децетен куркумин ам

Од областа на генетиката на човекот, теоретската медицина и биолошките науки или клиничката медицина на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Сар, Хомбург/Саар, ин витро и ин виво анализа на антиканцерогената активност на куркумин и децетен куркумин на малигнен меланом кај музеј Дисертација за да се добие диплома доктор на Природни науки Медицински факултет УНИВЕРЗИТЕТ ДЕС САРЛАНД 2014 поднесено од: Индра Навина Дамке родена на: 1 декември 1979 година во Кобленц

активност

Ден на промоција: Декан: проф. Д-р. М.Д. Менгер 1. известувач: проф. Д-р. Е.Мизе 2-ри известувач: ПД Др. М.В. Лашке

Во спомен на татко ми кој ме запозна со науката

Содржина I Содржина 1. Резиме. 1 2. Вовед. 5 2.1. Малиген меланом. 5 2.2. Куркумин. 6 2.2.1. Хемиски својства на куркумин. 9 2.2.2. Фармакокинетика на куркумин. 10 2.2.3. Фармакокинетика на куркумин кај луѓето. 11 2.2.4. Подобрување на биорасположивоста. 11 2.2.5. Токсичност. 12 2.2.6. Фармакодинамика на куркумин кај луѓето. 12 2.2.7. Молекуларни цели на куркумин. 13 2.3. MiRNA. 15 2.4. Сопствено прашање. 18 3. Материјал и методи. 19 3.1. Лабораториски материјали. 19 3.2. Клеточни биолошки методи. 19 3.2.1. Користени мобилни линии. 19 3.2.2. Култивирање на клетките. 19 3.2.3. Изолација на примарни човечки периферни мононуклеарни клетки. 20 3.2.4. Број на клетки. 21 3.2.5. Анализа на WST-1. 22 3.2.6. Цитометриски анализи на проток. 22 3.2.6.1. Одредување на цитотоксичност. 24 3.2.6.2. Одредување на фазите на клеточниот циклус. 25 3.2.7. Флуоресцентна микроскопска анализа. 25 3.3. Молекуларни биолошки методи. 26 3.3.1. Изолација на РНК од примероци на тумор. 26 3.3.2. Анализа на висока моќност на профилот на мирна. 27 3.3.3. При силициска анализа на клеточни сигнални патишта. 29 3.3.4. Квантитативно PCR во реално време од мирна. 29 3.3.4.1. Обратна транскрипција. 29 3.3.4.2. Квантитативна PCR во реално време (qrt-PCR). 30-ти

Содржина III 4.2.2. Пролиферација и апоптоза во моделот на грбната комора на кожата. 58 4.2.3. Раст на тумор и неоангиогенеза во моделот на туморот на крилото. 58 4.2.4. Изразување на NF-κB во тумори на крилото. 60 4.2.5. MiRNA профил на тумори на крилото. 60 4.2.6. Изразување на релевантни мирни во клеточните линии на меланомот. 64 4.2.7. Сугестивно регулирани патеки за сигнализација. 65 4.2.8. Цели на Мирна-205-5п. 66 5. Дискусија. 68 5.1. Ефекти на пиролитичките процеси врз куркуминот. 68 5.2. Ефекти на диетален куркумин врз меланом. 71 5.3. Заклучок и изгледи. 79 6. Библиографија. 81 7. Благодарници. 94 8. CV. 95 9. Публикации. 96 10. Додаток. 97

Список на скратеници IV Список на кратенки Сл. Слика Akt протеин киназа Akt, протеина киназа B al. alii APC Allophycocyanin APS ammonium persulfate Bcl-2 B-клеточен лимфом 2 BDMC Bidemethoxycurcumin bp basepare BRAF v-raf murine сарком вирусен онкоген хомолог Б1, серин/треонинпротеин киназа Б-Раф C-карциум Цациум калциум ЦД-ки комплет тирозин киназа KIT Cl хлорид c-myc myc миелоцитоматоза вирусна онкоген хомолог COX-2 циклооксигеназа 2 CTLA-4 цитотоксичен антиген Т-лимфоцит 4 Cur, CUR куркумин редистиран. двојно-дестилирана DEPC diethylpyrocarbonate DHC dihydrocurcumin DKC decetene curcumin DMC demethoxycurcumin DMSO диметил сулфоксид ДНК deoxyribonuleic киселина dntp deoxyribonucleoside трифосфат DTT дитиотреитол dutp 2-деоксиуридин ефективна епизода, 2-деоксиуридин транзиција 1-полу-epiphosphate, на почетокот од epiphytic протеин транзиција, 5-во-1-бисфосфат протеин концентрација 50, transymptive-полу-epiphosphate, 5-во-1-desoxyuridine, 5-во-1-бисфосфат максимална одговор. ХЕР, ЕГФР рецептор на човечки епидермален фактор на раст/еритробластична леукемија вирусна онкогена хомологна естроген рецептор алфа ФАКС сортирање на клетки активирана со флуоресценција ФДУ Администрација за храна и лекови g Gramm G1 Gap1 G2 Gap2

Список на кратенки V GFP зелен флуоресцентен протеин H водород h час Хепс на 2- [4- (2-хидроксиетил) пиперазин-1-ил] етансулфонска киселина HIF-1α-фактор предизвикан од хипоксија-1 алфа hsa Хомо сапиенс ICAM-1 меѓуцелуларен адхезивен протеин-1, ЦД54 ИгГ имуноглобулин Г ип интраперитонеална IRAK1 рецептор-асоцирана со рецептори киназа 1 i.v. интравенска IVM интравитална микроскопија на флуоресценција IκB инхибитор на капа Б kda килодалтон KEGG Кјото енциклопедија на гени и геноми кг килограми телесна тежина М 1 Г малондијалдехид-ДНК ма милиампер Метил група μg микрограм μл микролитар микрометар миг милиграм мг мигр милиграм мг мигр милиграм мг мигр милиграм мг комплекс за замолчување предизвикан од мирисс мирна, значи просечна ml милилитар mm милиметар mmu Musculus mol Mol mrna messengerrna mtor цицачи цел на рапамицин (серински/треонински протеин киназа) n број Na натриум NF-kB нуклеарен фактор-капа бета ng нанограм nm нанометар Отом на атом анализа на преголема застапеност

Список на кратенки VI p53 туморски протеин 53 PAGE полиакриламид гел електрофореза PBS посфат пуферен солен раствор на PCAF P300/CBP-асоциран фактор PCNA размножувачки клетки нуклеарен антиген PCR полимеразна верижна реакција PECAM, CD31 молекула на адхезија на ендотелијалните клетки на тромбоцитите PI пропидиум јодид p. рецептор активиран пролифератор на ППАР-γ пероксизом-γ РТЕН фосфатаза и тенсин хомолог PYR пиролизиран куркумин qrt-pcr квантитативна реакција на полимераза верижна синџир РНК рибонуклеинска киселина СН стандардна грешка на СП специфичноста на просечната СП1 фактор на транскрипција протеин 1 Src Тирозин киназа Src (сарком) T ден тон TBS-T Tris-пуфер солен раствор и Tween 20 TE Tris-EDTA пуфер TNF-α фактор на некроза на тумор-алфа TPA 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-ацетат Tris 2- Амино-2-хидроксиметил-пропан-1,3-диол t-тест Студентски t-тест Ултразвук на САД ултразвук VAV прото-онкоген vav VCAM-1 васкуларна клеточна адхезија-молекула-1, ЦД 106 w/v тежина по волумен СЗО Светска здравствена организација WST- 1 растворливо во вода забрзување на тетразолиум-1 xg n-пати поради гравитацијата на пр. на пример Ц степени Целзиусови

Резиме 2 и клеточни линии на човечки меланом се одвиваа со квантитативна верижна реакција на полимераза во реално време (qrt-pcr). Анализите на претпоставените цели на мирните регулирани со диетален куркумин покажаа дека тие се презастапени во клеточните сигнални патишта Биосинтеза на О-гликан, процесирање на протеини во ендоплазматскиот ретикулум и разни сигнални патишта поврзани со рак. Анализите на Western blot покажаа дека анти-апоптотичниот Б-клеточен CLL/лимфом 2 (Bcl-2) и размножувачкиот клеточен нуклеарен антиген (PCNA) се значително регулирани во тумори третирани со куркумин на овие цели. Сумирајќи, резултатите од оваа работа покажаа дека децетен куркумин, кој е повеќе токсичен за клетките на ракот отколку куркуминот, се формира со пиролитичка деградација при нормално готвење во домаќинството. Покрај тоа, беше демонстрирана фундаментална промена во потписот на мирна кај трансплантирани меланоми како резултат на диетален куркумин. Тука mmu-mir-205-5p беше најрегулиран најмногу. Докажано е влијанието на орално применетиот куркумин врз важна регулаторна мрежа кај тумори и ги потенцира потенцијалните придобивки од куркуминот во третманот на малигнен меланом.

Резимето 4 беше збогатено со биосинтеза на о-гликан, обработка на протеини во ендоплазматскиот ретикулум и различни патеки поврзани со ракот. Анализите на Western blot откриле дека од овие цели анти-апоптотичниот Б-клеточен CLL/лимфом 2 (Bcl-2) и пролиферирачкиот клеточен нуклеарен антиген (PCNA) се значително регулирани во тумори третирани со куркумин. Како заклучок, наодите од оваа теза демонстрираат дека декетен куркумин, кој е формиран како последица на пиролитичка деградација при заедничко готвење во домаќинството, покажува посилна токсичност врз клетките на ракот во споредба со куркуминот. Дополнително, куркуминот во исхраната предизвика длабока промена на потписот на мирна во пресадениот меланом со тоа што mmu-mir-205-5p е регулирано најзначајно. Документирано е влијанието на орално администрираниот куркумин врз важна регулаторна мрежа кај тумори и го потенцира потенцијалот на куркумин во терапијата на малигнен меланом.

Вовед 7 Сл. 2: Curcuma longa. О: Цртеж на растението куркума (Köhler, 1887). Б: Фотографија на ризоми и куркума во прав. Куркумин, комерцијално достапен, обично се состои од околу 80% куркумин и содржи и интермедијари за биосинтеза на зеленчук со сличен спектар на активност, како што е деметоксикуркумин (

17%) и бидеметоксикуркумин (

3%) (Слика 3). Додека куркуминот главно се користи како додаток во храна за боење (E100, природно жолто 3) во Европа и САД, неговата потрошувачка и употреба во традиционалната медицина се широко распространети во Југоисточна Азија. Повеќе од 2000 години, куркуминот се користи во традиционалната азиска кујна како главна компонента на кари и за боење слатки и се користи во медицински третман на инфекции и внатрешни болести (Амон, 1991; Ајгнер и Шолц, 1999). Со учество од 80% (околу 800.000 т во 2010 година), Индија е главниот светски производител на куркума, од кои 90% понатаму се обработува на домашниот пазар (Универзална стокова берза, 2012). Просечната потрошувачка е 2,0-2,5 g куркума на ден и лице и одговара на внесувањето до 100 mg куркумин (Chainani-Wu, 2003). За споредба, Европскиот орган за безбедност на храната во Велика Британија проценува дека 0,8-3,3 мг/кг телесна тежина на ден ги трошат возрасните (Европски орган за безбедност на храна, 2010).

Вовед 10 различни пропорции на транс-6- (4-хидрокси-3-метоксифенил) -2,4-диоксо-5-хексанал, ферулна киселина, ферулоил метан и ванилин (Ванг и сор., 1997). Куркумин е лесно растворлив во органски растворувачи како што се алкохоли или деметил сулфоксид (ДМСО), но само со потешкотии во водата. Ова доведува до намалена клеточна апсорпција во цревата и следствено на тоа до намалена биорасположивост. 2.2.2. Фармакокинетика на куркумин Предклиничките и клиничките студии на фармакокинетиката на куркуминот покажаа ниска системска биорасположивост и брз метаболизам на првиот премин и излачување на примарната супстанција. Една од првите студии на Валстрем и Бленоу (1978) покажа дека орално администрираната куркумин кај стаорци Спраге-Доули активно се транспортира од црниот дроб во жолчката и 75% се излачува со измет. Само мал дел беше откриен во плазмата и урината. Сл. 6: Метаболизам на куркумин (модифициран од Шарма, 2005) Екскрецијата на жолчката на куркуминот е за возврат посредувана од протеинот 2 поврзан со отпорност на повеќе лекови (MRP2) (Lee et al., 2012). Ин витро експерименти исто така беше

Материјалот и методите 21 се мијат со ладна PBS и клетките потоа се бројат рачно во комората за броење на Neubauer (хемоцитометар). Пуфер за лиза на еритроцити: 788 mg (10 mm) Tris-HCl 4,41 g (165 mm) NH 4 Cl хемикалии во 500 ml аква-бидист. растворете и чувајте на 4 С. 3.2.4. Броење на клетки За броење на клетките, 10 μl од клеточната суспензија се мешаа со 10 μл трипан сино (фактор на разредување: 2) и виталните (необоени) клетки беа изброени во комората за броење на Нојбауер (Слика 10). Бојата на сината трипан продира во оштетените клеточни мембрани и со тоа ги обележува не-виталните клетки. Втората количина од 10 μl на клеточната суспензија се меша со раствор на Турк и се става во комората за броење на Нојбауер за да се утврди бројот на бели крвни клетки. Оцетната киселина содржана во растворот Туркс ги лизира еритроцитите, така што тие се обоени во сина боја. Сл. 10: Комора за броење на Нојбауер. О: Шематски приказ на хемоцитометар во пресек. Б: Шематски приказ на областа за броење. Квадрантите што треба да се избројат се оцртуваат со црвена боја (Воерман, 2000). За да се пресметаат виталните PBMC, треба да се земат предвид волуменот на течност во комората за броење и разредувањето на клетките во растворите за боење. Областа

МАТЕРИЈАЛИ И МЕТОДИ 29 За да се најде изразното ниво на мирна помеѓу контролните и третманските групи, беше користен независниот, двостран студентски t-тест. Пресметаните P-вредности беа корегирани со стапката на лажно откривање (FDR) за повторено тестирање (Бенџамини и Хохберг, 1995). Дерегулирана мирна со коригирана P вредност од 20%, дијаметар на тумор> 15 mm и развој на ткивна некроза. Освен ако не е опишано поинаку, интервенциите се одвивале под интраперитонеална анестезија на кетамин-ксилазин (кетамин: 75 мг/кг, Кетанест, Фармација ГмбХ, Ерланген, Германија; ксилазин: 15 мг/кг, Ромпун, Баер, Леверкузен, Германија). По крајот на експериментите, на животните им се даде предозирање со пентобарбитал (200)

Материјали и методи 46 Сл. 18: Интравитална микроскопија на флуоресценција. Поставување на флуоресцентен микроскоп (FM) со жива пареа ламба (HBO), леќи на долги растојанија (LDO) и систем за видео документација со видео камера (VK) и ДВД-рекордер (ДВД). Податоците се оценети офлајн со помош на софтверот CapImage (Зејнтл, Хајделберг, Германија). Анализите вклучуваат мерење на големината на туморот [mm 2] и функционалната капиларна густина [cm/cm 2]. Ова е дефинирано како вкупна должина на перфузираните садови по видно поле. Во оваа работа беше анализирана функционалната капиларна густина на целосниот сфероид на туморот. 3.10. Модел на тумор на коленото Генерирање на тумори на крило и мерења на ултразвук се извршени со theубезна поддршка на netанет Руџитис-Аут, Институт за клиничко-експериментална хирургија, Универзитет во Сар. 3.10.1. Генерација на тумори на крилото Со цел да се генерираат тумори на крилото, машките глувци C57BL/6 беа накратко анестезирани со мешавина од 4% изофлуран и кислород. Секој глушец беше инјектиран субкутано со 1 × 10 5 B78H1 меланомски клетки по крило во волумен од 50 μl PBS.

Се применува материјал и методи 50. Во пост хок анализите, алфа-грешката беше прилагодена според Бонферони, со цел да се поправи повторуваното мерење. Вредност на П.