Компоненти на храната и нивното влијание врз патогенезата на автоимуниот дијабетес кај луѓето и
1 ТЕХНИШЕ УНИВЕРЗИТ МИНЧЕН Чаир за нутриционистичка физиологија Нутриционистички компоненти и нивното влијание врз патогенезата на автоимун дијабетес кај луѓе и глувци Даниела Бетина Милер Комплетна копија од докторската теза одобрена од Вајенстефан научен центар за исхрана, употреба на земјиште и одобрение на Техничкиот универзитет во Минхен Доктор на науки за домаќинство и исхрана Претседател: Испитувач на дисертацијата: Унив.-Проф. Д-р J. J. Hauner 1. Унив.-Проф. Д-р H. Daniel 2 апл.проф.д-р. А-Г. Зиглер Дисертацијата е доставена до Техничкиот универзитет во Минхен на и прифатена од Вајенстефан научен центар за исхрана, употреба на земјиште и животна средина на.
2 За моите двајца дедовци
3 Содржина Содржина 1 Задача Вовед и преглед на литературата Основи на дијабетес тип 1 Значење на генетиката Патогенеза и имунолошка позадина на дијабетес тип 1 Wheито и неговите протеински фракции Целијачна болест и поврзаност помеѓу дијабетес тип 1 и целијачна болест Влијание на пченичните протеини врз развојот на автоимун дијабетес кај животински модели Дијабетес тип 1 Влијание на факторите во исхраната врз развојот на автоимун дијабетес кај животинскиот модел на кравјо млеко и неговите протеински фракции Влијание на протеините на кравјо млеко врз развојот на автоимун дијабетес кај животинскиот модел Влијание на пченично и кравјо млеко кај дијабетес тип 1 Асоцијација помеѓу имунолошкиот систем поврзан со цревата и автоимуниот дијабетес Дополнителни компоненти на храната и нивниот можен потенцијал Поврзаност со дијабетес тип 1 Материјал и методи Истражувања на моделот глушец НОД Група глувци Протокол за диети Делумен експеримент 1 и Протокол за протокол за парцијален експеримент Протокол Делумен експеримент Јас
4 Содржина 3.2 Експериментални методи Екстракција на жито за добивање на протеински фракции Производство на протеински екстракти од храна или добиточна храна Електрофоретичко одвојување на протеинските фракции (страница на СДС) Определување на содржина на протеини во екстрактите Мерења на автогантитела на IgG инсулин во анализа на глувци и човечки серуми Радиолиганд анализа со компоненти на храна IAA со мерење на пилешкиот инсулин IgA инсулин автоантитела во серумите кај луѓето, статистички податоци Резултати Хранење експерименти со глувци НОД Потрошувачка на храна и развој на тежина на глувци НОД во експерименталните групи Делумен експеримент 1 Храна што содржи пченица и казеин во споредба со базална диета Кумулативен ризик од дијабетес кај глувците НОД во делумниот експеримент на преваленца на автоинтитела на инсулин НОД глувци на возраст од десет недели од животот во делумен експеримент Инциденца на дијабетес кај глувци НОД пред и по 25 недели од животот во делумен експеримент, парцијален експеримент 2 Колификација на компоненти од пченица и пченица ерација и квалитет на извлечените фракции на пченица Кумулативен ризик од дијабетес кај глувците НОД во делумен тест Преваленца на инсулин автоантитела на глувци НОД на возраст од десет недели во делумен тест II
6 содржини 5.1 Експерименти за хранење со глувци НОД Ефекти на различни извори на протеини врз развојот на дијабетес во моделот НОД Ефекти на застојани додатоци на пченица и индивидуални фракции на протеини од пченица врз развојот на дијабетес во моделот НОД Влијание на други компоненти на храна во исхраната на мали деца врз развој на дијабетес во моделот НОД -Model реактивност на хуман инсулин автоантитела со пилешко инсулин и мерење IgA изотип обврзувачка однесување на инсулин автоантитела кон пилешко инсулин во човечки серуми Идентификација на IgA инсулин автоантитела изотиповите во човечки серуми Склучување разгледување на тестови на обврзувачки својства и изотиповите на обврзувачки својства на инсулин автоантитела за да врзувањето на инсулин автоантитела кон инсулинот антителата на врзувањето на инсулин автоантитела кон инсулинот автоантитела кон инсулинот автоантитела врзување за инсулинските антитела обврзувачки Истражување на врзувањето на инсулин автоантитела со индивидуални протеини со компоненти на храна во човечки серуми Фракции на кравјо млеко Конечно разгледување на тестовите за вкрстено-реактивни инсулински автоантитела Идни изгледи Резиме и заклучоци Литература IV
7 Содржина Содржина. Список на фигури. Список на табели. Список на кратенки. I-V VI-VIII IX-X XI Претходни публикации. XII биографија. XIII-XIV благодарност. XV V
10 Список на слики Сл. 26 Поврзување на IAA со млеко, млечни протеини, формули и пченица во споредба со хуман инсулин Сл. 27 Обвивки на врзување на IAA со компоненти на храна Инсулин (дел 1) Сл. 30 Врзување на IAA со различни млечни протеини во споредба со инсулин (дел 2) Сл. 31 Врзување на IAA со различни млечни протеини во споредба со инсулин (дел 3) VIII
12 Список на табели Таб. 20 Анализа на концентрацијата на протеини во извлечените раствори на храна во разни разредувања и добиените средни вредности Таб.
13 Список на кратенки Листа на кратенки Слика Слика АК антитела аспарагин cpm радиоактивно распаѓање во минута (брои во минута) GAD (A) (антитела против) глутамат декарбоксилаза HLA комплекс на хистокомпатибилност (хуман леукоцитен антиген) I (A) A Инсулин (авто) антитело IA-2 ( А) (Антитела против) протеин тирозин фосфатаза IA-2 ИСА-островските клетки антитела Ig имуноглобулин MHC главен комплекс на хистокомабилност мин. Минути nb не е познато НОБ необичен дијабетичен RBA радиолигантен врзан анализа вртежи во минута круга во минута T1D тип 1 дијабетес. Табела TBST Tris пуфер солен раствор плус Tween TBT Tris пуфер Tween t-tg ткиво-трансглутаминаза наспроти Светската здравствена организација ZnT8 цинк транспортер 8 XI
16 задачи кои би можеле да се доведат во прашање како потенцијални првични целни антигени на IAA. Генерално, ова дело треба да го разработи можното влијание на индивидуалните компоненти на храната врз имунолошкиот процес на автоимун дијабетес. Користејќи ги податоците добиени in vivo на моделот NOD, потенцијалните дијабетогени компоненти на храната се тестираат на човечки серуми. Користејќи ги овие ин витро модели, ќе се испита до кој степен имунолошките настани на дијабетес тип 1 првично може да бидат активирани од вкрстени реакции со компоненти на храна. Резултатите од овие експерименти може да опишат понатамошни, претходно непознати механизми на патогенеза на дијабетес и на тој начин да се користат за развој на примарни терапии за да се спречи развојот на дијабетес тип 1 во раното детство. 3
41 Материјал и методи (диета Д), втората група остана на диетата А која содржи пченица и третата група остана на диета без пченица Б. femaleенските кученца во групата за размножување на глутен и диета Ц без казеин беа распоредени во тест група која се состоеше од три недели живот 9 женски животни кои останале на диета Ц (види слика 4). Парови за размножување Диета без глутен, содржана казеин Б диета без глутен и без казеин Ц Групи за тестирање Исхрана B n = 12 Исхрана A n = 12 Диета Д n = 12 Исхрана C n = 9 Сл. 4 Распределба на женските глувци НОД на групите за размножување и тест во делумниот тест 1. Машките млади животни од групата за размножување на диета Б без глутен беа одделени од браните по лактација на возраст од три недели како што е опишано за женските животни и поделени во три тест групи. Аналогно на групирањето на женските глувци, една од групите добила референтна диета (диета Д), втора доби диета А што содржи пченица, а третата група останала на диета Б без пченица (види слика 4а). Парови за размножување, диета без глутен, содржана казеин Б Групи за тестирање Исхрана B n = 11 Исхрана A n = 10 Диета Д n = 12 Сл. 4а Распределба на машките глувци НОД на групите за размножување и тестирање во под-експериментот 1а. 28
46 Материјал и методи Со цел да се одделат протеинските фракции содржани во пченицата едни од други, беше извршена модифицирана екстракција во три фази, при што во првиот чекор на екстракција албумини и глобулини беа присутни во супернатантот, во вториот чекор на екстракција проламините (глиадините) беа содржани во супернатантот и со Во последниот чекор, глутенините беа одделени (Вилсон и Гулдинг 1991, Мимуни и др. 1998, Николас и соид Идрис и др. 2003 година). Екстракција на брашно од албумини и глобулини Центрифугирање> 2x талог Екстракција на Глиадин Центрифугирање> 3х Глутелин екстракција на талог (N 2 атмосфера) Центрифугирање> 2x центрифугирање на сите супернатанти Врнежи Складирање на 18 C Слика 7 Шема на екстракција на протеини и одделување на фракциите од пченично брашно Се мерат 0,1 g комерцијално достапно пченично брашно од типот 550, се додава 1 ml пуфер Sörensen (pH 7,35) и смесата се тресе на 4 ° C 20 минути. По центрифугирање (20 мин., 1000 вртежи во минута, Sorvall RC 5B Superspeed Центрифуга) на 4 ° C, супернантот се отстрани и талогот се извлекува повторно со истиот метод по додавање на пуфер Соренсен. Двете супернанти се комбинираа и се чуваа на 4 ° C сè додека не завршија понатамошните фази на екстракција. 33
60 резултати Добивање количина на албумини и глобулини кои биле администрирани на глувците НОД со водата за пиење. За да се провери методот на екстракција, главните протеини на пченичното брашно беа фракционирани и чистотата на одвојувањето беше проверена со помош на гел-електрофореза (материјал и методи 3.2.3). Стандардни албумини и глобулини глутенини глиадини Сл. 10 Електрофоретичко одвојување на фракциите на пченичните протеини на полиакриламидниот гел од 12%. Индивидуалните протеински фракции се доделуваат на соодветните опсези и молекуларните тежини се прикажани во kda од левата страна. Покрај тоа, ефикасноста на екстракцијата се определи со квантитативно утврдување на протеини со комплет за анализа на протеини BCA (види таб. 16 и материјал и методи 3.2.4) и приближно 50% принос на посакуваниот дел од албумин и глобулин за извлекување поставени. 47