Лабораториски весник - Преглед на производ - Колекции за прочистување на антитела
Во академските лаборатории за истражување, антителата често се прочистуваат со употреба на афинитетни колони. Фото: Универзитет во Флорида
(01.09.2020) Комплетите за прочистување на антитела главно се засноваат на мали спинови колони или мониста кои се опремени со протеин А или Г. Израелска група разви интересна алтернатива без хроматографија.
Кое би било модерното истражување на животната наука без поликлонални (pAb) или моноклонални антитела (mAb)? Нема да остане премногу од тоа ако го игнорирате сеприсутниот PCR. Тешко дека постои експеримент или анализа во која малите помагачи не се вклучени и им го олеснуваат животот на истражувачите или им овозможуваат на прво место нивни експерименти. Антителата не се неопходни само во основните истражувања за безброј методи и протоколи кои се движат од имуноанализа, западни флеки, ЕЛИСА и имунохистохемија до микроскопија и сликање до цитометрија на проток. Тие се исто така важни алатки во клиничката дијагностика и сè повеќе се користат како активни состојки или терапевтски антитела за третман на разни болести.
Еден од најважните извори на поликлонални антитела или имуноглобулини (Ig) е крвната плазма на цицачите. Врз основа на тежината, околу дваесет проценти од протеините што ги содржи се антитела, кои се поделени во пет различни класи: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Првите три, исто така, играат важни улоги во рамките на имунолошкиот систем, но IgG и IgM најмногу се користат за истражувачки цели. IgM се појавуваат во раната фаза на примарниот имунолошки одговор на антиген, додека IgG се синтетизираат во големи количини во последователниот секундарен имунолошки одговор.
Истражувачите го искористуваат ова со инјектирање на антиген во зајаци, кози, овци или други цицачи и потоа обично изолирање и прочистување на IgG-овите формирани при имунолошкиот одговор од плазмата или антисерумот на животните. Во ерата пред комплет, тие први ги таложија плазматските протеини со амониум сулфат, кои ги додадоа во крајна концентрација од 25 проценти. По центрифугирање и отстранување на протеините, на ред дојдоа IgG, кои беа таложени со педесет проценти амониум сулфат.
Двете чекори на врнежи и последователната дијализа на растворот на антитела добиени со цел да се ослободат од амониум сулфат, сепак, бараат многу рачна работа и траат неколку дена. IgGs може да се изолираат многу побрзо и полесно со комплети за прочистување на антитела, кои се скоро целосно базирани на мали колони за афинитет или мониста кои се опремени со протеин А или протеин Г. По потекло од Staphylococcus aureus (протеин А) и Streptococcus sp. (Протеин G) добиени површински протеини се врзуваат со висока специфичност со Fc дел од многу IgG.
Додека протеинот Г има голем афинитет кон повеќето IgG, протеинот А е малку попребирлив и е тешко привлечен од IgG од хрчаци, стаорци или овци, на пример. За прочистување на афинитет, рекомбинантно изразените варијанти на протеини А и Г се прицврстени на хроматографските смоли или одделно или понекогаш во комбинација, или поврзани со површинскиот материјал на магнетни зрна. Честопати, еден чекор за хроматографија е доволен за да се постигне чистота на изолираните антитела повеќе од 98 проценти.
Во лабораториите за истражување, значително постабилните IgM, кои имаат тенденција да се собираат, често се чистат со афинитетни колони. Врзивната матрица што се користи тука не е протеин А или Г, туку протеин кој врзува маноза или лектин кој врзува маноза (МБЛ), кој е претежно имобилизиран на агароза.
За прочистување од поголем обем, протеините А и Г или други специфични лиганди за афинитетна хроматографија се прилично скапа забава. Производителите на антитела и фармацевтските лаборатории претежно се префрлаат на класична јонска хроматографија и ги полнат колоните со, на пример, многу поевтини анјонски разменувачи како диетиламиноетил (DEAE) агароза со цел да се добијат чисти IgG, IgM и особено моноклонални антитела (mAb). Но, дури и овие техники треба да се борат со општите недостатоци на методите за прочистување на хроматографијата - како што се ограничени капацитети за врзување, големо трошење на време и скапо одржување на уредите.
Затоа, некои групи упорно работат на алтернативи на хроматографските процеси, следејќи го слоганот што се слуша сè почесто: Сè, само без хроматографија (Сè освен Хроматографија, ABC). Еден од овие концепти за прочистување без хроматографија за антитела беше презентиран минатата година од групата на Гај Пачорник од универзитетот Ариел во Израел, заедно со колеги од Индија (МАБС 11 (3): 583-92). Бидејќи антителата може да се прочистат и со хидрофобна интеракција хроматографија (HIC), Пачорник претпостави дека антителата очигледно се врзуваат малку посилно со хидрофобни смоли отколку другите растворливи во вода протеини. Значи, според неговата идеја, тие исто така ќе мора да бидат зафатени со агрегати на хидрофобни детергенти.
Вработените во Пачорник ги генерираа агрегатите со тоа што прво го додадоа хидрофобниот хелатор батофенантролин (Бато) во воден раствор на Tween-20 и вртејќи ја смесата. Ова им даде на Твин 20 мицели, чии површини беа украсени со хидрофобниот дел од молекулите Бато. Потоа ги измешаа овие инженерски мицели со раствор на железен сулфат и повторно се вртеа. Натамошната реакција потоа се одвивала практично автоматски: јони Fe 2+ формираат хидрофобни (Бато) 3: Fe 2+ комплекси со молекулите на Бато позиционирани на фазната граница помеѓу мицелите и водата, кои ги вкрстуваат мицелите и формираат хидрофобни Твин -20 единици олово.
Израелците тестираа дали агрегатите се погодни за прочистување на антитела со мешавина од поликлонални IgG на човекот што содржат лисат од E. coli како вештачка контаминација. Постапката за чистење што ја користеа за ова е многу едноставна: мешавината на антитела се инкубира пет минути со претходно направените агрегати Tween-20 и потоа се центрифугира две минути. Потоа IgGs може да се изолираат од агрегатите за неколку минути со употреба на 50 милимоларен раствор на изолеуцин (pH 3,8). Целата работа работи и во медиум без серум хибридома, кој обично се користи за производство на моноклонални антитела - како и во присуство на алвимин на говеда во серум (BSA), кој исто така често се наоѓа во медиумите на клеточна култура за производство на антитела.
Бидејќи и чистотата на IgG изолирани со агрегатите Tween-20 и приносот се само малку полоши отколку со хормографијата на афинитет протеин А, Пачорник е убеден дека неговиот метод е вистинска алтернатива на конвенционалното прочистување. Тој дури може да замисли дека ќе ги замени столбовите на протеините А во прочистувањето на терапевтските антитела.
Групата на Ana Cecília A. Roques на Universidade Nova во Лисабон заобиколува прочистување на хроматографските антитела со комбинација на афинитетен лиганд, врнежи и магнетни наночестички (Biotechnol. J. DOI: 10.1002/biot.202000151).
Трите индивидуални техники секако не се нови. Ново е, сепак, нивното спојување за да се формира позната како афинитетна магнетна врнежи. Во суштина, ова е крајно едноставно - најкомплицираниот чекор е производство на магнетни наночестички кои се опремени со триазин лиганд кој специфично се врзува за антитела.
Честичките потоа се мешаат со 20 проценти PEG3350, што служи како талог. Суровиот екстракт се инкубира со смесата еден час на 4 ° C и се тресат на орбитален шејкер. Потоа се применува магнетно поле за петнаесет минути со цел да се одделат преципитираните магнетни честички со антителата што се прилепуваат кон нив од супернатантот. Антителата потоа нежно се отстрануваат од наночестичките со неутрален раствор на PBS.
Користејќи го овој метод, тимот на Роке изолирал поликлонални антитела од човечки серум со 50% принос и чистота од осумдесет проценти. Португалецот постигна уште подобри вредности за прочистување на моноклонални антитела.
(Прва публикација: H. Zähringer, Списание за лаборатории 9/2020, заклучно со август 2020 година, сите информации без гаранција)
Последни измени: 01.09.20020
© 1996-2020 Уредувачка содржина: LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Фрајбург, дизајн и програмирање: f + r интернет агенција, Фрајбург,
Слики и графики - освен ако не е поинаку наведено - со соодветните автори и фотографи.