Лабораториски журнал - Методи - Оптимизиран клеточен културен медиум
Мирја Краузе
Производството на растворливи рекомбинантни протеини во бактериските клетки не секогаш работи непречено. Мирја Краузе објаснува како новоразвиениот систем на клеточна култура En Base може значително да ја зголеми густината на клетката и количината на растворлив протеин по клетка.
Во суштина, задачата на клеточните култури кои се користат за изразување на рекомбинантни протеини е многу едноставна: тие треба да произведуваат растворливи протеини што е можно поактивни. Со многу стандардни протоколи на клеточна култура, ова работи само делумно или понекогаш воопшто. Најпознат протокол за одгледување на клетки од E. coli во тресечки колби е веројатно протоколот Самбрук, кој е наведен во „Библијата за молекуларна биологија“ на Том Манијатис. Повеќе од 20 години, молекуларните биолози го користат овој протокол како водич, кој често работи - но не секогаш.
Протеините кои можат да се изразат само слабо или воопшто да не се користат со помош на Самбрук или друг стандарден протокол, обично се сметаат за „тешки кандидати“ за кои се потребни посебни трикови. Овие случаи се појавија и во нашата работна група и ние често баравме ленти со изразен протеин во гелови со SDS-PAGE со лупа.
Прејадени бактерии
Причината за слабиот принос во експресијата на протеините во бактериските култури е често феномен што се јавува и кај луѓето: бактериите едноставно се прејадуваат. Медиумите за тресење култури обично "работат" како сериски култури и ги содржат сите компоненти и хранливи материи за понатамошна култура од првата секунда. Процесот е претежно неконтролиран, т.е. не се контролираат важни параметри како што се pH вредноста, количината на растворен кислород и концентрацијата на глукоза во медиумот.
Како резултат, високата стапка на дишење на брзорастечките бактерии ја надминува брзината на пренос на кислород во културата. Ова брзо резултира во осиромашување на кислородот, а со тоа и ограничување на растот. Бактериите сега растат бавно и го намалуваат производството на протеини. Тие го прилагодуваат нивниот метаболизам на условите на анаеробната култура и ослободуваат метаболити кои ја намалуваат pH вредноста. Покрај тоа, неконтролираната количина на глукоза присутна во стандардните комплексни медиуми доведува до вишок метаболизам. Ова предизвикува акумулација на дополнителен ацетат, што дополнително ја намалува pH вредноста на културниот медиум се додека конечно „не се разболат“ прејадените бактерии.
Целата работа се зајакнува кога колбите за тресење - како што е вообичаено во многу лаборатории - се затвораат со памучни затворачи, алуминиумска фолија или метални капачиња. Преносот на кислород во културите се намалува на нула и се забрзува преминот во анаеробни, т.е. неповолни услови на култура. Решение за транспорт на кислород во колбите се нуди со самолепливи, стерилни, еднократни запечатувачки мембрани, т.н. AirOtop заптивки. Мембраните AirOtop не дозволуваат никакви микроби однадвор во културата, туку кислород. Проблемот со прејадување опишан погоре сè уште останува.
Со цел да ги одржат клетките здрави, реакторите за ферментација користат таканаречен процес на храна-серија за континуирано пумпање на дефинирана количина гликоза во реакторот. Во исто време, сензорите ја контролираат pH вредноста и содржината на кислород. На овој начин може да се постигне многу висока густина на клетките и да се зголеми производството на растворливи рекомбинантни протеини.
Но, како може принципот на храна-серија да се пренесе од биореактори во тресени колби или микротитерни плочи? Едноставно: ставајќи ги бактериите на „диета со шеќер“.
Средно од Финска
Пред неколку години, групата на Питер Нојбауер на Универзитетот во Оулу во Финска развија систем на клетки култури EnBase (ензимски заснован на супстрат) што ослободува глукоза во медиумот на контролиран начин преку ензимско варење на скроб (Panula-Perälä et al., Microbial Cell Фабрики 2008, 7:31). Во меѓувреме, инженерот за биопроцеси Neubauer се пресели од крајниот север во ТУ Берлин и создаде свој медиум наречен EnBase Flo со неговиот тим, кој содржи полимери кои ослободуваат глукоза во растворлива форма.
Диета со шеќер
Со EnBase Flo, количината на глукоза во медиумот може да се контролира преку ензимската концентрација (глукоамилаза) што е поставена во културата (Krause et al., Microbial Cell Factories 2010, 9:11). Диетата со шеќер го спречува штетниот вишок метаболизам во бактериите и гарантира дека pH вредноста останува стабилна подолго од два дена и со тоа значително подолго отколку со ЛБ-медиумот во кој вредноста на pH е константна само за шест до осум часа. Таканаречените таблети за засилување дополнително го зајакнуваат ефектот на стабилизирање на pH. Така, бактериите остануваат здрави и можат да се одгледуваат под контролирани и стабилни услови во кои постигнуваат значително поголема густина на клетките. Покрај тоа, приносот на растворлив, активен протеин се зголемува до десет пати. Во меѓувреме, EnBase Flo Medium, кој не е погоден само за лабораториска скала, туку и за процеси со голема пропусност, исто така е достапен во форма на таблети под името EnPresso, што го прави одгледувањето уште полесно.
Следниот краток протокол илустрира колку е едноставна културата на клетките со системот EnBaseFlo. Потребно ви е: стерилна колба од 500 ml, стерилна вода, антибиотици, индуктор и комплет таблети енпресо. Првиот чекор е да се подготви предкултура. Ова може да се инокулира од течна култура преку ноќ, стапче со глицерол или од агар плоча. Потоа, во стерилни услови, додадете 500 мл стерилна вода и две средни таблети во колбата од 500 мл, почекајте додека таблетите не се растворат, а потоа додадете го потребниот антибиотик и 50 μL EnZ’Im (глукоамилаза). Потоа, предкултурата се инокулира (ОД 600 = 0,05-0,15), колбата се затвора со мембраната AirOtop и се започнува со културата. По култивирање преку ноќ (16-20 часа), се додаваат таблета засилувач, 50 μL EnZ’Im и индуктор. Одгледувањето потоа се продолжува и се собираат клетките по 24 часа.
Последни промени: 23.02.2011 година