Мерење на животниот век во протоколот Drosophila melanogaster (Превод на германски)

Резиме

Drosophila melanogaster е моќен модел за истражување на молекуларната основа на регулирање на долговечноста. Овој протокол ќе дискутира за чекорите вклучени во генерирање на репродуктивно, мерено според популацијата на животниот век, како и потенцијалните стапици и како да се избегнат истите.

Апстракт

Стареењето е феномен што резултира со стационарно физиолошко влошување на скоро сите организми во кои е проучено, што резултира со намалени физички перформанси и зголемен ризик од заболување. Индивидуалното стареење се појавува на ниво на популација како зголемување на смртноста поврзана со стареењето, што често се мери во лабораторија со набvingудување на животниот век кај големи групи на луѓе на иста возраст. Експериментите за обид да се измери степенот до кој генетските или еколошките манипулации влијаат на животниот век кај едноставните модели на организми биле неверојатно успешни за разбирање на аспектите на стареење што се релевантни за таксоните и за инспирирање на нови стратегии за продолжување на животниот век и спречување на болести поврзани со стареењето кај цицачите се зачувани .

Протокол

Препорачуваме да чувате експериментална храна, паста од квасец и плочи од грозје агар, кои се појавуваат во протоколот на 4 ° C и да ги користите во рок од 1-2 месеци, се додека формата и сувоста не се поставени. Стандардните услови на животната средина и за ларвите и за возрасните вклучуваат одржување на сцената Лета во инкубатор на 25 ° C со светло-темно циклус 12:12 ч и релативна влажност од 60%.

А. Подготовка за експериментално готвење

За раст на ларвата, ние користиме модифициран Caltech Medium 5, кој во овој протокол е скратено како КТ.
Препорачуваме диета за возрасна Дрософила (СИ) која се состои од шеќер (сахароза) и квасец (лиофилизиран квасец од пивара) во 2% агарна основа што е варена, дополнета со антибиотици и антифунгални агенси и дисперзирана (10 ml на шишенце) 6. Треба да се остави храна да се зацврсти и да испари 12-24 часа пред да се чува. Бидејќи хранливата околина може значително да влијае на долговечноста, методите за конзистентно готвење се неопходни и во рамките на експериментот и за споредба помеѓу експериментите.
Ако треба да се додаде фармаколошки агенс во храната за возрасни, овој лек може да се меша во мала група храна и да се напласти (2 ml) на површината на храната со контролни шишенца кои содржат слоеви на возило.

2. Подгответе жива паста за квасец

Комбинирајте 5-6 ml вода со 3 g сув квасец и добро измешајте. Конзистентноста на пастата од квасец мора да биде онаа за мазен путер од кикирики.

3. Подгответе чинија со агар од грозје

Додадете пакет од премија со грозје агар на 500 мл дестилирана вода во шише од 1.000 мл и следете ги упатствата на пакувањето за да се раствори мешавината на агар од грозје.
Внимателно истурете дебел слој од смесата во садови Петри од 100 мм, избегнувајќи клокоти. Пакет Премикс произведува околу 14 плочи од агар од грозје.
Оставете медиумот да се лади и зацврсти на собна температура со вклучен капак 15 мин. Плочите може да се чуваат на 4 ° C, да се завиткаат во пластична фолија или да се користат веднаш.

4. Колекција на синхронизирани јајца

Сите медиуми што се користат во овој протокол, т.е. квасец, плочи од грозје агар, КТ и храна со 10% СИ, треба да бидат на собна температура.

5. Колекција возрасни муви возрасни

Возрасните обично ќе излезат од 9 ден наваму од првиот ден. Отфрлете ги мувите што се појавија првиот ден и ставете ги шишињата повторно во инкубаторот преку ноќ. Оваа практика ќе избегне случајни избори за почетни појави и за собирање на максимален број синхронизирани муви.
16-22 часа подоцна, возрасниот ден лета во 10% шишиња со храна SY. Доколку е потребно, може да се собере друга група следниот ден.
Лета назад во инкубаторот и им дозволува на мувите да достигнат сексуална зрелост и да се парат два дена. Запишете го денот на пренесување на 10% шишиња SY како прв ден од зрелоста.

6. Подредување муви и поставување експеримент за долговечност

Анестетизирајте мали групи муви на подлогата за анестезија, а потоа сортирајте ги мажите и жените во две групи со четка. Кога се користи CO 2, важно е да се минимизира изложеноста на можни долгорочни здравствени проблеми што можат да го загрозат интегритетот на експериментот за долговечност.
Ставете 30 муви од ист пол во индивидуални шишенца. Под претпоставка дека нема балансирачки хромозоми во популацијата и здрави потомци, секое шише треба да произведе приближно 3-4 ампули од секој пол. Аликтуирање на муви во индивидуални шишенца не треба да надминува 3-4 мин., Така што мувите се изложени на анестезија само 9-10 мин.
Повторете ги чекорите до 6.1-6.2. Има 8-10 повторувања на шишенцата за секој пол и експериментална терапија.

7. Поставете ја табелата за Excel за да го следите експериментот за долговечност

Препорачуваме рандомизирање на положбата на вијалата, наместо на групирање на вијалите по експериментална состојба, со цел да се избегне закосување во положбата на вијалата во инкубаторот и да се скрие идентитетот на вијалата на експериментаторот. За да го направите ова, прво доделете рандомизиран нумерички ID на секоја вијала во програмата за табеларни пресметки, а потоа наредете ги шишенцата во тацна според ID број. Ако користите софтвер за управување со експерименти dLife, следете ги упатствата за поставување експерименти за да генерирате матичен број за секоја вијала.
(По избор) Ако користите читач на РФИД или читач на баркодови во соработка со dLife, прикачете РФИД или баркод-ознака на секоја вијала и поврзете ја ознаката со ампулата со нумеричката идентификација во dLife. Програмата ја препознава секоја вијала кога се скенира со читач и започнува да ги снима податоците на правилно место во табела. Употребата на читач на ознаки заедно со dLife го намалува времето на стекнување податоци и грешките при снимањето.

8. Одржување на експериментот за долговечност

Ампулите со свежа храна треба да бидат на собна температура за секој пренос.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Поедноставена шема на протоколот е во илустрација 1, каде што се наведени важните чекори. Делот за синхронизација на протоколот може да бара возрасни муви прилагодени за возраста за различни анализи.

Прикажани се типичните кривини на стапки на преживување од муви од див тип Слика 2а прикажано со помош на софтверот за управување со експерименти dLife (Слика 2б, в). Возрасните мажи претежно живеат пократок живот, обете популации постигнуваат просечна и просечна долговечност> 50 дена на 10% СИ храна на 25 ° C. Забележете дека преживеаниот останува висок во раниот дел од експериментот, а потоа паѓа експоненцијално.

Esивотниот век на дрозофилата е под влијание на условите на животната средина, како што се температурата и исхраната. Слика 3а покажува дека возрасните мажи обично живеат значително помалку како што се зголемува температурата. Исто така, ефектот на диетата е доживотен во 3б подароци: Возрасни жени летаат на помалку концентрирана диета (5% SY) обично живеат значително подолго од оние на поконцентрирана диета (15% SY).

Густината на групите за време на развојот може да влијае на животниот век на возрасните и да го смени времето на развој. Овде покажуваме пример за тоа како различните густини на синхронизираните јајца влијаат на развојот на ларвата. Како што во 4 прикажано, приносот на мува кај возрасни е слаб и површината на храната е склона кон сушење кога бројот на јајца е премал. На другиот крај на спектарот, развојот на ларвата е одложен во преполнети шишиња и се намалува приносот на возрасни муви.

Кривата на преживување на групата како целина може да биде значително под влијание на абнормални ефекти на вијалата, како во Слика 5 прикажано. Нередовните податоци за преживување за одделни ампули може да имаат неколку причини, како што се слаб квалитет на храна или акумулација на бактерии/габи и инфекции. Додека ваквите абнормални смртни случаи не можат да ја искриват мерката за преживување на населението, не постои едноставна метрика за соодветно утврдување дека вијалата треба да биде исклучена од експериментот. Затоа, овие ситуации најдобро се избегнуваат со добро ракување и се ублажуваат со користење на голема големина на примерок.

илустрација 1. Поедноставена шематска претстава за животна анализа на Дрософила.

Слика 2. (А) Репрезентативни кривини на животниот век w 1118 контролираат женски (кругови) и машки (квадрати) возрасни муви на 25 ° C на храна со SY10%. (B, C) Претставнички слики од екранот на софтверот dLife.

Слика 3. Ефекти на температурата (A) и храната (B) врз животниот век на возрасните. A. Машки муви за контрола на возрасни (Кантон С) се чувале на 18 ° C до зрелоста, 25 ° C или 29 ° C. controlенски мушички за контрола на возрасни (со 1118) биле хранети со диета со 15% или 5% SY SY.

Слика 4. 9-ти ден на развој (на 25 ° C) синхронизирани јајца, поделени во шишиња со храна КТ. Волуменот на количеството што содржи ембрион е прикажано како под секое шише.

Слика 5. Претставничкиот запис од софтверот dLife покажува стапка на преживување на шишенцето. Стрелката покажува една вијала ненормална во групата.

Слика 6. Примери за неоптимален квалитет на храна. A. Плускавци на површината на прехранбената индустрија. Б. Храната се оддалечи од работ на шишенцето. C. пукнатини во храната. D. Акумулација на бактерии на површината на храната.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Протоколот презентиран овде опишува метод за правење репродуцирачки мерења на долговечноста кај возрасните кај Дрософила, кој е прилагодлив за проценка на генетски, фармаколошки и еколошки интервенции. Централните аспекти на протоколот вклучуваат внимателна контрола на развојната околина на ларвите, минимизирање на стресот кај возрасните и минимизирање на пристрасноста над експерименталните групи и контроли. Исто така, воведуваме употреба на софтвер за управување со доживотно искуство dLife. Со едноставно прицврстување на бар-код или РФИД-ознака на секој сад, програмата ќе помогне во стекнување на податоци за dLife за секое мерење и во цртање на кривата на стапката на преживување. Иако во моментот е најдобро прилагодена за проучување на животниот век на мувата со употреба на шишенца, оваа алатка за управување со експериментот може лесно да се прилагоди за употреба во други организми, со различни типови на комори за население или за дополнителни мерки, вклучувајќи отпорност на стрес и преживување Токсичност на лекови.

Важните аспекти на контролирање на околината на ларвата/кукла вклучуваат избегнување на пренатрупаност и одржување на контролирана средина со строго регулирање на светло-темните периоди, влажноста и температурата. Овие фактори влијаат и на развојот на времето и на физичкиот квалитет на добиените возрасни лица. Несакани ларвални средини, како што е висока густина на ларвите, може да доведат до активирање на фактори предизвикани од стрес (на пример, израз на протеини од топлински шок), за кои се знае дека влијаат на долговечноста на возрасните 18.

Предложени се алтернативни пристапи за хранење во анализата на животниот век, вклучувајќи пристап на капиларна фидер (метод CAFE) 23. Овој метод е значаен по својата способност да обезбеди прецизни мерења на потрошувачката на храна, но доведува до значително повеќе краткотрајни муви 24. Можните стресови поврзани со животната средина треба да се користат при проценка на комбинираната врска помеѓу исхраната и генетските фактори во целокупната долговечност волја.

Демографската анализа, вклучително и пресметката на кривите за преживување и смртност, може да открие многу информации за динамиката на стареење на населението. Типична крива на преживување ќе остане релативно рамна за подолг период рано во животот и ќе ја зголеми стапката на опаѓање кај постарите жени, што одговара на период на ниска смртност проследен со период на експоненцијално зголемување на смртноста. Стресната околина обично ќе се манифестира како вишок на предвремени смртни случаи кај популацијата и ненормално опаѓање во кривата на преживување. Иако ваквиот резултат може да даде значителни разлики помеѓу третманите, тој обично нема да биде силен во репликација. Затоа препорачуваме да се направат најмалку два независни (т.е. нетранзирни) експерименти за реплицирање пред да се донесе цврст заклучок. Можеби ќе бидат потребни дополнителни напори за зголемување на големината на примерокот, контрола на условите за домување и подобрување на здравјето на родителските растенија.

Десна цензура (отстранување на животни од експериментот за кој постои сомневање дека избегал или умрел од случајни причини) на животни кои умираат од стресни услови на животната средина треба да се примени со голема претпазливост. Строго кажано, апаратот за цензура мора да се појави по случаен избор низ експериментални третмани, и ако експерименталниот интервенцијам ја модулира чувствителноста на стресот, може ненамерно да се применат избори на ниво на третман врз популацијата. Како општо правило, избегнување на присуство на двосмислени фактори што можат да предизвикаат рана смрт (особено поврзано со изворот на храна) е подобро од уредот за цензура, а цензурата треба да се применува само на организми забележани да умираат или да избегаат додека физичка манипулација.

Конечно разгледување е проценката на статистичкото значење. Додека големите кохортни големини на примероците обезбедуваат импресивни перформанси во разликувањето на малите разлики помеѓу третманите, мора да се земе предвид и потенцијалното биолошко значење на таквата разлика. Со прилично големи експерименти за долговечност, разликите честопати се дури 2,1% статистички многу значајни, но целокупното влијание на интервенцијата врз здравствениот статус може да биде мало. Оттука, мора да се даде и статистичка и биолошка важност при толкувањето на вкупните резултати од експериментот. Заклучокот за процесот на стареење од експериментите за преживување може да се надополни со мерки на опаѓање на возраста во однесувањето или физиолошките здравствени мерки, вклучително и способност за искачување 25 и интегритет на гастроинтестиналниот wallид 7.

Како заклучок, организмот на моделот Дрософила е привлечен избор за проучување на механизмите за стареење. Со внимателна експериментална техника, робусната демографска анализа може да обезбеди увид во ефектите на фармаколошките и генетските фактори врз процесот на стареење.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.