Протокол за анализа на потрошувачката на енергија Данио Рерио со голема пропусност (превод на германски)
Апстракт
Вовед
Глушецот во моментов е доминантен модел за истражување на дебелината. Интервалот со кратка генерација и генетските алатки достапни во глувчето се неспоредливи до сега. Сепак, зебрафисот има краток интервал на генерација (3-4 месеци), па дури и го надминува глувчето во едноставна генетска манипулација 1,2. Зебрафисот одржува скоро 90% од гените на цицачите, додека глушецот одржува далеку над бројот на потомци и потенцијалот за употреба во генетските и екраните со лекови 3.
За да се отклучи потенцијалот на моделот зебрафиш за студии за дебелина, треба да се развијат тестови за да се испитаат факторите што влијаат на регулирањето на телесната тежина, вклучително и потрошувачката на енергија Како метаболити, кислородот се обработува преку β-оксидација и се троши циклусот на трикарбоксилна киселина и се произведува NADH 2. Така, NADH 2 е директен индикатор за проток на метаболити низ метаболичките патишта (оксидација на метаболит). Во покилотермите, H + истекува низ внатрешната митохондријална мембрана, оксидацијата на NADH 2 раздвоена од ATP синтезата е 4-5 пати помала отколку кај топлокрвните животни 4. Соодветно на тоа, кај зебра рибата NADH 2 е многу цврсто поврзан со производството на ATP со оксидативна фосфорилација поврзани. Овде опишуваме тест што го мери производството на NADH 2 во ларви од зебра риба како прокси за потрошувачка на енергија 5.
Потрошувачката на кислород е златен стандард за мерење на потрошувачката на енергија. Сепак, најдобро е да се искористи високиот потенцијал на пропусна моќ на анализата за зебра риба, бидејќи потрошувачката на енергија мора да биде достапна за голема пропусност. Системите за потрошувачка на кислород, кои зависат од системот за циркулација на затворена комора, се ограничени во пропусната моќ од бројот на присутни комори 6. Анализи за производство на потрошувачка на О 2/CO 2 на отворено се применети и во зебра рибата 5.7. Овие плочи на отворено од 96 бунари од BasisD Systems се достапни за голема пропусност. За жал, размената на гас со околината ја ограничува чувствителноста на овие анализи. Неодамна објавивме примена на анализа која го следи NADH 2 со индикаторот за редокс аламарБлу 5. Овој тест ги надминува ограничувањата во пропусната моќ и чувствителноста во заедничките анализи за потрошувачката на кислород во зебрафисот.
Зебрафисот е сè поважен модел за проучување на хомеостазата за енергија на целото тело. Делумно затоа што зебра рибите се достапни во иднина со користење на генетски екрани и екрани со лекови. Покрај тоа, целната генетска манипулација, вклучително и доплата и нокаут, може да се примени брзо. Претходно покажавме дека овој тест може да се комбинира со испорака на лекови за бања и генетски додаток, или нокаут, за да се идентификуваат соединенија и гени кои ја менуваат метаболичката стапка 5. Покрај тоа, овој тест треба да се искористи за предностите со голема пропусност, својствени за рибарската риба.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
ЗАБЕЛЕШКА: Овој протокол ги следи упатствата на Канцеларијата за одговорни истражувања на Универзитетот во Аризона и е одобрен од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни
1. Одгледување и одржување на ембриони од зебрафиш
2. Подгответе раствор за тестирање
- Подгответе го тест-растворот според Табела 1. Стерилен раствор за анализа на филтерот користејќи филтер од 0,22 µm. Пред да започнете со тестот, загрејте го стерилниот раствор за тестирање во водена бања од 28,5 ○ C.
| компонента | % Од вкупниот број | Волумен (ул/10 мл) |
| 60x E3 ембрионски медиум | 1.667 | 166,7 |
| Двоен дејонизиран (DDI) H 2 0 | 96.233 | 9.623.3 |
| Алама сино- | 1 | 100 |
| 400 мм NaOH | 1 | 100 |
| ДМСО | 0,1 | 10 |
Табела 1 Средна анализа
4. Проценете ја релативната промена на флуоресценцијата поврзана со третманот
- Промена на флуоресценцијата од секоја пресметка исто така со одземање на флуоресценцијата во времето 0 од флуоресценцијата на крајот на студијата. Бунарите без риба (празни места) треба да имаат вредности близу 0, далеку под вредностите на бунарите што содржат риба.
Промена на флуоресценција = флуоресценција на крајот - флуоресценција на време 0 - За да се утврди релативната промена на флуоресценцијата, пресметајте ја просечната промена на флуоресценцијата за контролните бунари, а потоа поделете ја промената во флуоресценцијата секоја со просечната промена на флуоресценцијата за контролните бунари. За забелешка, контролите може да бидат или контроли на возила или генетска контрола.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Анализиран раствор не-флуоресценција во отсуство на ембрионална риба (1) да зголеми. Сепак, тестот е многу чувствителен на мали промени во метаболичката стапка во дупнатината. Една риба во бунар создава јасен сигнал од празни бунари во рок од 1 час (Потребна е претплата. Ве молиме препорачајте JoОVE на вашиот библиотекар.
Дискусија
Бактериска или габична контаминација во голема мера ќе ја ограничи примената на оваа анализа. Метиленското сино во ембрионскиот медиум Е3 ја ограничува можноста за контаминација со габи. За време на одгледувањето на ембриони, важно е да се внимава да се отстранат мртвите ембриони двапати на ден. Дополнително, важно е темелно да се анализираат ембрионите со стерилен медиум Е3 ембрион на денот на подрачјето на започнување на анализата. Овие 2 чекори го ограничуваат потенцијалот за бактериска контаминација на ембрионите. Вклучувањето на празни бунари опишани во чекор 3.2 овозможува откривање на каква било контаминација на бактериите. Бактериска контаминација што дава мерлив сигнал е ретка. Меѓутоа, ако празните бунари покажат сигурен сигнал, анализата треба да се повтори, треба да се внимава да се одржи чистотата на ембрионот. Ако корисникот очекува дека има контаминација пред оплодувањето, ембрионите може да се обелат како што е опишано погоре (стр. 22) 10. Алтернативно, ако експериментаторот се сомнева дека контаминација се јавува по собирањето, корисникот може да го врати Е2 назад со пеницилин и стрептомицин. да се користат ембриони до 4 dpf (стр. 23) 10.
Иако овој тест е вреден за употреба во ембриони, ние не ја испитавме неговата валидност кај возрасни зебраши. Се сомневаме дека сите функции на овој тест ќе бидат ограничени кај возрасни риби со слаба пенетрација на ткивата на AlamarBlue. Покрај тоа, при хранење риба, цревната флора може да произведе длабок сигнал кој нема никаква важност за метаболизмот на рибата. Така, овој тест се базира на употреба во жолчка од јајце што храни ембрионална риба. Релативната неактивност на ембрионалната риба нуди единствена предност бидејќи тоа ја ограничува варијабилноста што би била поврзана со потрошувачката на енергија предизвикана од активност 11. Значи, овој тест е единствена алатка за проучување на метаболичката стапка како одговор на генетска или фармаколошка манипулација во целиот систем на животни.
Зебрафисот брзо станува водечки модел за метаболички нарушувања кои ја придружуваат дебелината. Всушност, постојат модели и на трансгенска и на диета поврзана со дебелина на зебра, објавени 12,13. Слично на моделите на глувци, дебелината предизвикана од диета кај зебрашисот ја зголеми серумските триглицериди и акумулацијата на липидите во црниот дроб 12. Покрај тоа, храната на зебрафисот ја зголеми гликозата на гладно, што укажува на нетолеранција на глукоза. Инсулин сензибилизатор, ја зголемува метаболичката стапка како одговор на тестот за третман на инсулин 5. Така, зебрафисот може да се покаже како идеален модел на цело животно за да открие лекови кои ја подобруваат чувствителноста на инсулин (ембрион) и да ја утврдат нивната ефикасност во ослободувањето на дебелината од инсулинска резистенција (возрасни).
Развојот на генетски и диети-индуцирани дебели зебриски модели кои имитираат фенотипови забележани кај дебели цицачи создава поттик за започнување умирања од зебра-рис фокусиран на метаболички болести. Анализи со голема пропусност се достапни за целосно проценување на вредноста на моделот зебрафиш за проучување на енергетската хомеостаза. Иновативни алатки за да се овозможи проценка на фагичен погон за екраните фокусирани на внесот на енергија, додека тестовите со голема пропусна моќ за складирање на липиди ќе доведат до студии на хомеостаза на липиди во целото тело 15-17 Анализата што ја опишуваме овде е висока алатка за пропусност да се оцени вклученоста на гените, соединенијата или нивните интеракции врз потрошувачката на енергија на целото тело.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.