Синергетска употреба на нервни претходници на клетки и само-склопувачки пептиди во експериментален грлото на матката

Апстракт

Вовед

Повеќе од 50% од повредите на 'рбетниот мозок на цервикалниот' рбет. Во клинички се опишани два главни патофизиолошки механизми: почетната контузија на 'рбетниот мозок и последователно тековните компресивни фрактури на коските, крварење или оток на ткивата предизвикан.

Моделот на стегање/компресија на стегачот во аневризмата ги имитира и патофизиолошките механизми: крцкањето на клипот создава нотка и времетраењето на клипингот претставува компресија на компресијата, овозможувајќи компресија во клиничко опкружување предизвикано од фрактури на коските, крварење или отекување на ткивото значително подолго. Користениот клип за аневризма се менува со прстенеста пружина која гарантира точна и репродуктивна сила на отсекување. Особено кога ќе се спореди со моделот на хеми-транссекција или контузија, овој модел на клипови за аневризма ги имитира најдобрите клинички средини. Додека пациентите со повреди на градниот кош страдаат од параплегија, повеќето пациенти со повреди на грлото на матката се квадриплегични и се целосно зависни. Анатомската структура на цервикалниот мозок, сепак, значително се разликува кога ќе се спореди со структурата на торакалниот или лумбалниот 'рбет, а со тоа особено со протоколот.

Развојот на медуларни шуплини и лузни во ткивата се бариери за закрепнување и регенерација. За да се надминат овие пречки, употребата на материјал за скеле е ветувачки пристап. Пептидите што можат да се соберат може да се инјектираат директно во епицентарот на лезијата. Таму тие се ставаат во скелиња со нанофибер кои ја премостуваат празнината и ја подобруваат инхибиторната средина со намалување на воспалението и застрашувачки ткива. Додека крутите материјали предизвикуваат значителна штета на 'рбетниот мозок за време на имплантацијата, пептидите со течност може да се инјектираат безбедно и без сериозно дополнително оштетување.

Подобрување на инхибиторната средина со самоорганизирање на пептиди пред трансплантација на матични клетки, затоа поддржува интеграција на клетките, диференцијација и на крајот функционално закрепнување по повреда на цервикален 'рбетниот мозок.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

ЗАБЕЛЕШКА: Следниот експериментален протокол е одобрен од Комитетот за нега на животни на здравствената мрежа на Универзитетот (Торонто, Канада) и е основан во согласност со упатствата во Упатството за грижа и употреба на експериментални животни изготвено од Канадскиот совет за грижа на животните .

1. Модел на контузија/компресија на аневризма на грлото на матката

2. Инјекција на SAP и NPC (14 дена по повредата)

90% живи клетки во клеточната суспензија. Разредете ги клетките во медиум за раст (50 x 103 живи клетки/ул) и користете ги за трансплантација на клетки.

  • Направете четири 2 μl (вкупен волумен на 8 μl, со 4 x 10 5 NPC) интраспинални инјекции билатерално на 2 мм рострална и опашка до местото на повредата. По отворањето на дурата, ставете го камиларот Хамилтон микро стакло 1,5 мм под грбната површина на 'рбетниот мозок и инјектирајте 2 μl од клеточната суспензија. Изберете стапка на инјектирање околу 0,5 ml/min (мин).
  • На крајот од секоја инјекција и пред да го извадите капиларот од кабелот, почекајте најмалку 1 мин за да се истегне ткивото за да се смести новиот волумен на клетката. (Слика 2)

    • 3. Имплантација на субдурални пумпи за примена на фактор на раст

    1. Sртвувајте ги животните на крајот од периодот на набудување (на пример, 4 недели по SCI) под длабока анестезија (5% изофлуран за 2-3 мин) и исплакнете ги транскардијално со 50 ml ладен (4 ° C) солен раствор, проследен со 150 ml ладен 4% Параформалдехид во солен раствор на фосфат од 0,1 М (PBS).
    2. Отстранете го 'рбетниот мозок и натопете го во 4% параформалдехид во 0,1 М солен раствор на фосфат (PBS) за 24 часа.
    3. Ставете го 'рбетниот мозок во 25% раствор на сахароза за криопрезервација 48 часа.
    4. Обезбедете надолжни криосекции со потребна дебелина на претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    При извршување на горенаведената постапка, скелето САП ја премостува шуплината и обезбедува подобрување на инхибиторната средина, помалку лузни во ткивата и зголемување на преживувањето на НПЦ, Сл. 4 покажува надолжен пресек на 'рбетниот мозок на стаорец до местото на повредата добиена 6 недели по SCI и 4 недели по QL6 SAP инјекцијата и трансплантација на NPC. QL6 пептидите беа успешно инјектирани во срцевината, агрегирани во епицентарот и дифузни ростро-каудални во полуомразата. Сликата со електронски микроскоп понатаму покажува во Слика 5, каде што распоредот на 1% (w/v) QL6 пептиди на скеле со нано-влакна се разредува во PBS раствори во рок од 2 часа.

    Оваа матрица обезбедува подобрување на инхибиторната средина со зголемено преживување и диференцијација на клетките, помалку лузни во ткивата и на крајот доведува до подобра можност за функционална реставрација.

    уре 1 "src ="/датотеки/ftp_upload/52.105/52105fig1highres.jpg "/>Слика 1: Модел на аневризма на контузија/компресија на клип (А) Фотографија преку хируршки микроскоп по ламинектомија на C7/T1 и контузија на клип/компресија на 'рбетниот мозок на стаорец (Б) Гарантирајте ја сликата на клипот со прстенестата пролет прецизно. Сила на затворање.

    претходници
    Слика 2: Инјекциски точки на SAP и матични клетки Графички приказ на Инјекциски точки:. 2 стереотактички водени SAP инјекции во епицентарот на лезијата, проследени со 4 инјекции на NPC во соседните дорзални колони на растојание од 2 mm каудално и рострално од епицентарот.

    претходници

    3: Субдурален катетер за администрација на фактор на раст Фотографирање преку хируршки микроскоп: (А) Имплантирани субдурални катетри за испорака на фактори на раст. катетерот е прикачен со неколку 6.0 конци каде што се прикачени параспиналните мускули; мало отворање на дурата кај C5; Субдурално позиционирање на катетерот со отворен крај на катетерот во близина на лезијата кај C7/T1. (Б) Катетер поврзан со микро пумпа во субдурален вдлабнатина прикачен на страничното крило.

    синергетска
    Слика 4: Успешна испорака на SAP и NPC во цервикалната срцевина Флуоресцентно боење (позадина DAPI, сина) за надолжен пресек на трауматизиран 'рбетниот мозок стаорец. Етикетирани SAP (QL6-FITC, зелена) се собрани во епицентарот на лезијата. Инјектираните НПЦ (DsRed позитивни, црвени) се во дифузна рустална и опашка насока. Скала-лентата означува 5 мм.

    претходници
    Сл. 5: Формирање на рамка на нанофибер Скенирање на електронски микроскоп (СЕМ) на слика покажува нано-влакна скеле на монтирани SAPs. Лентата за скали се однесува на 1 мм).

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Овој протокол е дизајниран за да му овозможи на читателот да изврши модел на повреда на вратот кај стаорци и да користи комбиниран пристап на третман со SAP и NPC, промовирајќи подобро закрепнување по SCI на вратот.

    Особено кога ќе се спореди со другите модели на повреди на 'рбетниот столб, како што се моделот (хеми) -трансекција или моделите за губење на тежината и потресот на мозокот, моделот клип-контузија/компресија претставува два главни трауматски патофизиолошки механизми - модринки и притисок - и затоа ги имитира најдобрите клинички Услови. Иако е поставен за употреба кај стаорец и глувчето BWS 7-11 неодамна, тој е погоден за употреба во цервикалниот 'рбет. Ова беше важен чекор затоа што повредите на цервикалниот 'рбетниот мозок се најчести во клиниката, а анатомијата на грлото на матката е многу различна од онаа на торакалниот' рбет. Покрај тоа, пациентите со врат SCI со тетрапареза се обидуваат барем делумно да го обноват моторното помазание на горните екстремитети.

    Пептидите за самосоставување се идентификувани со потенцијалите за премостување на шуплината, а исто така и за подобрување на инхибиторната средина на местото на лезијата, што на крајот дури доведува до регенерација на аксоните и никнува 5, 12,13,14. Нано-влакната QL-6 се собираат за да создадат скелиња кои премостуваат медуларна празнина и на тој начин можат да обезбедат матрица за аксонско никнување и регенерација и подобрување на инхибиторната средина пред трансплантацијата на клетки. Предностите на овие пептиди лежат во нискиот вискозитет (течност) и неутралната pH вредност. Особено во споредба со многу слатки хидрогели или скелиња на ткива, САП лесно може да се инјектираат во повредениот 'рбетниот мозок и понатамошните повреди добиени од самата инјекција се ограничени.

    Иако самите QL6 нано-влакна можат да го подобрат опстанокот на клетките 4,15, сепак употребата на фактори за раст се чини дека е корисна за 16,17,18,19,20,21. Тие можат да се администрираат преку фактори на раст без хидрогели 22 или преку примена преку осмотски пумпи (како што е опишано погоре). Осмотските пумпи поврзани со субдурални катетри имаат предност во континуираното и контролирано ослободување, а со тоа и збогатување на течноста на цервикалниот 'рбетниот мозок (ЦСФ). Уредувањето на субдуралниот катетер е предизвик, особено во однос на големите лузни што се случија неколку недели по повредата.

    Со цел да се создадат добри услови на ткиво за преживување и интеграција на НПЦ, неколку студии избраа точки на инјектирање во соседната бела маса, 2 мм рострална или опашка на лезијата, а не директно во епицентарот на лезијата 4,15,18. Таму, НПЦ имаат поголема шанса за преживување, интеграција и диференцијација во астроцити, олигодендроцити и неврони, и можат да мигрираат кон или во лезијата што резултира во аксонско никнување и подобрена асонска поврзаност.

    По совладувањето на овие техники, овој предложен протокол може да биде прифатен од индивидуалниот корисник во согласност со нивните потреби и интереси, промените на нивото и сериозноста на повредата, употребата на различни типови на клетки или фактори на раст, или заедно со други невро-заштитни материи .

    Во лузни со празнини и ткива: Сумирајќи, комбинираниот третман со SAP и NPC може да понуди нов и ветувачки пристап кон надминување на најтешките пречки во третманот на SCI.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Признанија

    Ние би сакале да ја препознаеме поддршката за финансирање на оваа работа од Канадскиот институт за здравствено истражување (ЦИХР), Фондацијата за семејство Крембил, Халберт Чаир за поправка и регенерација на нервите, Филип и Пеги ДеЗвирек и Гордон Јао за придонесот на 2 Клаус Цвекбергер беше поддржан од грант од „Дојче Форшунгсгесшелшафт“ (ДФГ).