Влијанието на пренаталниот стрес врз миелинизацијата и формирањето на нервната мрежа
Влијанието на пренаталниот стрес врз миелинизацијата и формирањето на нервната мрежа во мозокот на феталните овци Дисертација за добивање на академска диплома лекар medicinae (Dr. Dr.) презентирана пред Советот на Медицинскиот факултет на Универзитетот Фридрих Шилер во Јена од iaулија Квент родена на 5 септември 1987 година во Гота
Рецензент: 1. Проф. медицински Матијас Шваб/Јена 2. Проф. медицински Ричард Бергер/Новид 3. ПД Др. медицински Ден на јавна одбрана Бернд Ромејке/Јена: 6.05.2014 г.
Содржина Содржина СПИСОК НА АБРЕВИЈАЦИИ I 1 РЕЗИМЕ 1 2 ВОВЕД 3 2.1 Клиничко значење на пренаталниот стрес за плодот 3 2.2 Развој на мозокот на плодот 5 2.2.1 Развој на ембрионалниот мозок 5 2.2.2 Размножување на клетките и миграција 5 2.2.3 Невронска и глијална диференцијација 6 2.2.4 Церебрална миелина 7 2.2.4.1 Структура и биохемиски состав на миелинската обвивка 7 2.2.4.2 Функција и важност на миелинската обвивка 9 2.2.4.3 Потекло и диференцијација на олигодендроцитите 10 2.2.4.4 Временски тек на миелинизација 11 2.3 Ефекти на пренаталниот стрес врз развојот на мозокот кај фетусот 13 2.3.1 Церебрални ефекти на мајчиниот стрес 13 2.3.2 Церебрални ефекти на пренатална глукокортикоидна терапија 14 2.3.3 Регулирање на стресната оска 16 2.3.4 Ефекти на мајчиниот стрес и пренаталната глукокортикоидна терапија врз развојот на стресната оска 18 2.4 Механизми на ефектите на пренаталниот стрес 19 2.4.1 Пренос на мајки Стрес на фетусите 19 2.4.2 Ефекти на глукокортикоиди со посредство на рецептори 20 2.4.3 Пренатален стрес и хормони за раст 21 2.5 Цел на работата 22
Содржина 3 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ 25 3.1 Експеримент 25 3.1.1 Експериментален протокол 25 3.1.2 Добивање на фетални мозоци и производство на примероци 27 3.2 Хистохемиско и имунохистохемиско боење 28 3.2.1 Преглед на боење со хематоксилин-еозин 28 3.2.2 Импрегнација на сребро според Bielschowsky 29 3.2.3 Имунохистохемиско откривање на МБП 31 3.3 Светлосно микроскопско и компјутерско оценување 35 3.4 Статистичка проценка 39 4 РЕЗУЛТАТИ 40 4.1 Тежина на телото и мозок по пренатален стрес 40 4.2 Церебрални ефекти на пренаталниот стрес 42 4.2.1 Формирање на невронски процеси во белата маса 42 4.2.1.1 Субкортикална бела материја 42 4.2.1.2 Корпус калозум 47 4.2.1.3 Длабока бела материја корона радијата 49 4.2.1.4 Внатрешна капсула 51 4.2.2 Миелинизација на невронските процеси во белата маса 53 4.2.2.1 Субкортикална бела материја 53 4.2.2.2 Корпус калозум 58 4.2.2.3 Длабока бела материја - Corona radiata 60 4.2.2.4 Капсула интерна 62 4.2.3 Форма Формирање на невронски структури во хипокампусот (регионот CA3) 64
Содржина 5 ДИСКУСИЈА 69 5.1 Дискусија за методите 69 5.1.1 Anивотински модел 69 5.1.2 Стресен модел 70 5.1.3 Хистологија 72 5.1.4 Квантитативна анализа на сликата 74 5.2 Дискусија за резултатите 75 5.2.1 Пренатален стрес и раст на фетусот 75 5.2.2 Ефекти на пренаталниот стрес врз хипокампусот 78 5.2.3 Церебрални ефекти по пренатален стрес на нервната мрежа 79 5.2.4 Церебрални ефекти по пренатален стрес на миелинизација 82 6 ЗАКЛУЧОЦИ 84 7 ЛИТЕРАТУРА И ИЗВОРИ 86 8 ПРИЛОГ 102 8.1 Благодарници 102 8.2 Почесна изјава 103
Список на кратенки Список на кратенки ABC ACTH ADHD AK AP + T AP + T + S Aqua dest. AVP BM CNP (p) crh GR GT HE HHN -аксија 11ß-HSD2 IGF MAG MBP MOG MR MW OMgp PBS PLP REM RT SEM SSW Avidin-Biotin-Complex Adrenocorticotropic хормон Дефицит на внимание/нарушување на хиперактивноста Антитела работен пуфер Работен пуфер + Triton-X-Тритон-X + Тритон + Серум Аква дестилата (дестилирана вода) аргинин-вазопресин бетаметазон 2-3-Цикличен нуклеотид 3 -фосфохидролаза (плацентарна) кортикотропин-ослободувачки хормон глукокортикоиден рецептор на гестација ден (и) хематоксилин-еозин хипоталамистички хипоталитик Хидроксистероид дехидрогеназа тип 2 Инсулин фактор на раст како гликопротеин поврзан со миелин, миелин базен протеин миелин/олигодендроцитен гликопротеин минералокортикоиден рецептор Средна вредност Олигодендроцитен миелин протеин Фосфат пуфер Протеолипиден протеин Брзо движење на очите Температура на собата Стандардна грешка на просечната вредност
2 Индукција на первентрикуларна леукомалација (оштетување на белата маса за време на предвремено породување) во време на 0,65 од бременоста (што одговара на 24-та и 28-та недела од бременоста кај човечкиот фетус), висок степен на споредливост на развојот на мозокот помеѓу плодните овци и луѓето. Ова беше поткрепено со фактот дека во овој временски прозорец започнува созревањето на олигодендроцитите во феталниот мозок на овците и во исто време може да се забележи голем ризик од оштетување на незрелите, перивентрикуларни, бели материи кај недоносени бебиња (Back et al., 2006, 2001) . За време на раѓањето, мозокот на создаденото лице покажува нешто повисок степен на зрелост отколку кај луѓето (Мекинтош и сор. 1979, Астром 1967). Ова може да сугерира дека креативниот ум созрева побрзо во последниот триместар. 12-ти
2 Вовед координиран физиолошки одговор на различни концентрации на кортизол (Поглавје 2.4.2). Сл.2.3: Хипоталамус-хипофиза-надбубрежна оска и патеки на негативни повратни информации. Кортикотропин ослободувачки хормон (CRH), аргинин вазопресин (AVP), проопиомеланокортин (POMC), адренокортикотропен хормон (ACTH), паравентрикуларно јадро (NPV). Изменето од Метјус 2002 година. 17
2 Вовед покажува временски тек на развој на мозокот сличен на оној на луѓето, дури и ако созрее малку побрзо. Генерално, беа проценети мозоците на 45 работници кои беа хронично под стрес помеѓу 0,20-0,66 гестации (30-ти до 100-ти ГТ) со изолирање на нив 180 минути во два дена во неделата. Бидејќи овците се стадо животни, изолацијата е главен стрес за овој вид. Со цел да се прикажат можни трајни ефекти, мозоците биле оценети во времето 0,73 (110 ГТ, времетраење на бременоста 150 дена) и 0,86 гестација (130 ГТ). Резултатите имаат за цел да помогнат да се разјаснат ефектите на пренаталниот стрес врз функцијата на мозокот во подоцнежниот живот. 24
3 Материјали и методи изолирани во уши на други животни, така што на крајот на протоколот секое животно беше изложено на индивидуална изолација 20 пати. Бидејќи овците се стадо животни, тие се особено чувствителни на овој стрес. Мерењата на нивото на кортизол пред и за време на изолацијата го потврдија овој ефект (Rakers et al. 2012). Стрес група Контролна група Синхронизација на циклусот еструс и закажано парење ВО СПОРЕДУВАЕ Соодветно одгледување од слободен опсег кај овчар Транспорт на бремени животни во тест-лабораторија Стрес преку изолација 2 пати неделно за 3 часа Хронична инструментација Добивање на мозокот на фетусот - Група 1 Добивање на мозокот на фетусот - Група 2 Природен термин за достасување Сл .3.1: Експериментален протокол Помеѓу 100-тиот и 110-тиот ГТ, фетусите биле инструментирани со употреба на катетри, кои биле користени за проверка на реакциите на интраутериниот стрес (ослободување на ACTH и кортизол). Нивната проценка не е предмет на ова дело (види Rakers 2012). По завршувањето на експериментите и оперативниот развој на фетусите, беа утврдени тежината на нивното тело и мозок. Овие мерења беа направени на 26
3 Материјал и методи на растечка алкохолна серија дехидрирани и затворени со монтажен медиум Neo-Mount (MERCK GmbH, Дармштад, Германија). Деталниот протокол на боење е прикажан во Табела 3.2. Средно дексимирање: 2x Neoclear 2x изопропанол 100% 1x изопропанол 80% 1x изопропанол 50% дестилирана вода. Импрегнација со сребро: AgNO 3 20% 2x аква дест. Амонијак раствор на сребро нитрат дестилирана вода + nh 3 (4: 1) Na тиосулфат 5% дестилирана вода од чешма. Дехидратација: Изопропанол 50% Изопропанол 80% 2х Изопропанол 100% 2x Неоклеарно вклучување на балзам со ентеланско време [мин]/темпен. [C] 10/RT 5/RT 5/RT 5/RT 3/RT 90/37 30/45 1- 3/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT Табела 3.2: Протокол за импрегнација на сребро според Bielschowsky. RT собна температура. Растворите се подготвуваат на следниов начин: 20% раствор на сребро нитрат (AgNO 3): 100 ml дестилирана вода. + 20 g сребро нитрат 5% натриум тиосулфат (Na 2 S 2 O 3): 100 ml дестилирана вода. + 5 g натриум тиосулфат Подготовка за раствор на развивач: 25 ml дестилирана вода. + 125 mg лимонска киселина (Fluka Chemie, Buchs, Германија) + 5 ml 36% формалин (Carl ROTH GmbH, Карлсруе, Германија) + 8 µl концентрирана азотна киселина-ENT 3 (Fluka Chemie, Buchs, Германија). 30-ти
3 Материјал и методи 2xAP + T ABC комплекс: АП + Т + раствор А + раствор Б АП + Т 2х PBS дестилирана вода. 3'3-диаминобензидин (DAB) 2x аква дест. Дехидратација: изопропанол 50% изопропанол 80% 2x изопропанол 100% 2x Неоклеар 100% вклучување на балзам со Entellan 5/RT 60/37 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 5/RT 10/RT 20 μl од растворот A и B во 1 ml AP + T 1Set (H2O2 + DAB) за 5 ml дестилирана вода, филтрирајте со филтер Millipore Табела 3.3: Протокол за имунохистиохемиско откривање на MBP. Растворите се подготвуваат на следниов начин: Цитратен пуфер: 1 литар дестилирана вода. + 2,94 g натриум цитрат (Fluka Chemie, Бухс, Германија), pH 6,0. PBS: 1 литар дестилирана вода. + 1 g работен пуфер D-PBS: 500 ml PBS + 2,5 g говесен серумски албумин (албумин од говедски серум, минимум 98%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Стернхајм, Германија) + 250 μl TWEEN 20 (полиоксиетилен сорбитан монолаурат) (Сигма- Олдрих Чеми ГмбХ, Стернхајм, Германија) ph 7.5. Раствор DAB (подлога Sigma Fast DAB): 2 таблети (уреа водороден пероксид и 3,3-диаминобензидин) во 5 ml дестилирана вода. се врти додека готовите таблети не се растворат целосно. 34
3 Материјал и методи Слика 3.3: Боење со преглед на НЕ изменето, според Атлас на мозокот на овци, Банка за биодиверзитет на мозокот во Државата универзити во Мичиген, Национална фондација за наука. https://www.msu.edu/
мозоци/мозоци/овци/индекс.html, 15.02.2012 година. Лево: Субкортикална бела материја во фронталниот кортекс: во близина на кортексот [1] и далеку од кортексот [2]; Корпус калозум [3]; Корона радијата [4]; Внатрешна капсула [5]; СВ: странична комора. Десно: регионот CA3 во хипокампусот: вентрален дел [1], дорзален дел [2] 36
3 Материјал и методи По дигиталното складирање, снимките беа оценети во програма за обработка на слика (Scion Image 1,62 NIH, САД). Прво, сликите во боја беа претворени во црно-бели слики со 256 нивоа на сива боја. Областа на позитивното обележување во рамките на репрезентативниот дел е утврдена со анализа на слика. Областа на импрегнација со имуноабела/сребро ја рефлектира имунохистохемиската дистрибуција на антигенот/густината на клеточните процеси. Во споредба со микроскопската слика, горната и долната вредност на прагот беа поставени под визуелна контрола. Овие вредности на прагот формираат опсег за селективно претставување на позитивната имунореактивност на МБП или на нервните влакна во сребрена боја. (види слика 3.4, црвена ознака). Сл.3.4: Анализа на слика со помош на сиви вредности А: Микроскопска слика: Невронски процеси во субкортикалната бела маса на далечинскиот управувач на фронталниот кортекс од кортексот. 37
3 Материјал и методи Б: Означување на екстензии на обоени клетки на сликата во сива скала Во споредба со микроскопската слика, во сивата слика е дефинирана сива површина (на црвена слика на сликата), што одговара на позитивниот сигнал на импрегнацијата на среброто. Оваа област се мери со програмата за анализа на слика. 38