Анализа на експресија на гените - Биологија

На Анализа на експресија на гени се однесува на истрага за спроведување на генетски информации (изразување на гени) со употреба на молекуларни биолошки и биохемиски методи. Може да се користи и за индивидуални записници и за целиот транскриптом и овозможува да се дадат квалитативни и квантитативни изјави за активноста на гените. Додека во првиот случај треба да се знае само информацијата за редоследот на преписот што треба да се испита, целата анализа на секвенцата на транскриптомот е потребна за анализата на транскрипцијата.

Во молекуларната биологија, активноста и експресијата на илјадници гени може да се мерат истовремено со помош на анализа на генската експресија, што овозможува преглед на клеточните функции. Профилите на генска експресија може да се користат, на пример, за идентификување на клетките кои се во активна фаза на поделба или за да се покаже одговорот на клетките на специфичен третман. Многу вакви експерименти го испитуваат целиот геном, т.е. секој ген на одредена клетка.

Техниката на ДНК микроериум [1] ја мери релативната активност на претходно идентификуваните целни гени. Методи засновани на секвенци, како што е сериска анализа на генската експресија (SAGE, SuperSAGE) исто така се користат за анализа на генската експресија. SuperSAGE е особено точен бидејќи овој метод не е ограничен на однапред дефинирани гени, но може да измери кој било активен ген. Со воведувањето на методите за секвенционирање на следната генерација, анализата на изразување заснована на секвенци ужива зголемена популарност како дигитална алтернатива на микро-низите Сепак, почесто се користат микро-ареи, како што е прикажано со употреба на овој метод во 17.000 статии од PubMed до 2006 година.

Дали генот е изразен воопшто под испитувани околности?
Во кои клетки се случува изразување (на пример, хибридизација in situ)?

Колку е голема разликата во изразот во споредба со дефинираната референца?
- здрави наспроти заболени клетки
- Див тип наспроти мутантни клетки
- нестимулирани наспроти стимулирани клетки

Во зависност од методот, се анализираат производите на различните нивоа на генска експресија:

Методи

Со хибридизација на самото место, специфичната низа РНК на дефиниран ген/ген сет е откриена во ткивото и се одредува локалната шема на експресија на гени.

Во методот Northern blot, РНК најпрво се изолира и електрофоретски се одделува според нејзината големина во гел. Откако ќе се пренесе на мембрана (размачкување), бараната низа на РНК се открива со обележани сонди (радиоизотопи, флуоресцентни бои) направени од комплементарна РНК или ДНК преку комплементарно врзување. Како по правило, само мал број секвенци се испитуваат истовремено.

Кај ДНК микрорегулите или макрорежините, количината на mRNA на голем број гени од клетките на културата/ткивото може да се утврди истовремено. За таа цел, mRNA е изолирана и транскрибирана во cDNA. Во овој метод, откривањето се одвива преку комплементарна хибридизација на обележаната cDNA (радиоизотопи, флуоресцентни бои) со сонди на ДНК низата.

Со сериската анализа на генската експресија (SAGE) и особено SuperSAGE, изразот на теоретски сите гени на клетката може да се одреди многу прецизно со генерирање на краток дел од низата (т.н. „ознака“ = ознака) од секој препис, и што е можно повеќе од овие ознаки се секвенцирани. Предноста во однос на микро-зраците е многу попрецизната квантификација на транскриптите, како и можноста (особено со SuperSAGE) да се идентификуваат нови транскрипти (на пр. Некодирачки рибонуклеински киселини како што се микроРНК или антисензутни РНК) и да се испитаат организми со претходно непознати геноми.

Квантитативната PCR во реално време е варијанта на полимеразната верижна реакција (PCR). Боите или специјалните сонди додадени во реакционата мешавина ја следат концентрацијата на производот за време на PCR. Промената на концентрацијата со текот на времето овозможува да се извлечат заклучоци за почетната концентрација на предметната нуклеинска киселина.

Со методот Western blot, протеините се одделуваат во однос на различните својства како што се големината, електричниот полнеж или изоелектричната точка и потоа се откриваат со антитела. Како по правило, само контролиран број на генски производи се испитуваат истовремено.

Диференцијалната анализа на 2D гелови овозможува изразување на до 10 000 протеини истовремено. За таа цел, протеинските екстракти се добиваат од клеточни култури/ткива, одделени се дводимензионално според изоелектричната точка и молекуларната маса и се откриваат и квантифицираат со етикетирање или разни (флуоресцентни) техники на боење. Одредените интензитети на различни примероци се споредуваат едни со други и со тоа се следи однесувањето на изразот во различни услови.

Во протеинските низи, аналогно на ДНК-низите, се испитува количината на одредени протеини. Бројните интеракции помеѓу протеините и другите молекули се користат за откривање: Интеракција на ензим-супстрат, антитело-антиген или рецептор-гласник.

Во последниве години, масената спектрометриска анализа на протеински мешавини станува сè поважна. Користејќи го „спектралното изобилство“, се бројат пептиди на протеински парчиња, слични на ДНК-фрагментите на постојните РНК во SAGE, и нивната фреквенција е така квантифицирана. Други методи го користат интензитетот на сигналот на одредени пептиди во масениот спектар како мерка на фреквенцијата.

Во многу методи се користат флуоресцентни бои кои се споени со сонди (РНК сонди, антитела и сл.) И се видливи со помош на флуоресцентна спектроскопија или флуоресцентна микроскопија. Вториот нуди предност на висока просторна резолуција. Покрај тоа, се користат радиоактивно обележани сонди или оние што ги претвораат хромогените во бои со помош на споени ензими.

Споредба со протеомиката

Хуманиот геном содржи околу 25.000 гени кои работат заедно за да создадат околу 1.000.000 различни протеини. Оваа разновидност се јавува главно преку пост-преведувачки модификации, така што еден ген може да послужи како образец за многу различни верзии на протеин. Околу 2000 протеини [5] (0,2% од вкупниот број) можат да се идентификуваат во еден експеримент со масена спектрометрија. Да се знае за индивидуалните протеини кои ги произведува клетката (протеомика) е порелевантно отколку да се знае колку mRNA произведува секој ген. Сепак, анализата на генската експресија дава најдобар можен преглед што може да се добие во еден експеримент.

Користете за развој и тестирање на хипотези

ограничувања

Валидација на методите на висока пропусна моќ

И ДНК микрорејчињата и qPCR користат склопот на врзување на комплементарни низи на нуклеинска киселина („базно спарување“) и двата методи се користат, често последователно, за да се создадат профили за изразување на гени. Додека ДНК микроаразиите имаат висока стапка на пропусност, на нив им недостасува голема квантитативна точност на qPCR. Меѓутоа, во исто време потребно е да се утврди експресијата на неколку десетици гени со qPCR, целиот геном може да се испита со користење на ДНК микроалери. Од оваа причина, често има смисла прво да се изврши полу-квантитативна анализа на ДНК микроелементи за да се идентификуваат кандидатите гени, што потоа може да се потврди и поточно да се измери со помош на qPCR. Дополнителни експерименти, како што е Западно размачкување на протеините на диференцијално изразените гени, може да помогнат да се потврдат резултатите од анализата на генската експресија, бидејќи концентрациите на mRNA не мора да се во корелација со количината на протеини изразени.

Статистичка анализа

Анотација на гени

Со помош на статистички методи, со сигурност може да се идентификуваат гените чии производи се менуваат под експериментални услови. За значајно толкување на изразните профили, од суштинско значење е да се знае кој протеин е кодиран според кој ген и каква функција има. Овој процес се нарекува анотација на гени. Некои прибелешки се посигурни од другите, а понекогаш и тие се целосно отсутни. Базите на податоци за генетски анотации постојано се менуваат, а различни бази на податоци користат различни имиња за ист протеин, како одраз на промена во разбирањето на неговата функција. Употребата на стандардизирана номенклатура на гени го избегнува проблемот со различното именување, но точното доделување на транскрипти на гени [13] [14] останува важен предизвик.

Класификација на регулирани гени

Следниот чекор по идентификување на група на диференцијално регулирани гени е да се бараат модели во рамките на таа група. Дали протеините за кои кодираат овие гени имаат слични функции? Дали се хемиски слични? Дали се наоѓаат во слични оддели на ќелии? Анализата на генската онтологија обезбедува вообичаен начин за дефинирање на овие односи. Генската онтологија започнува со многу широка горна категорија, на пр. „Метаболички процес“, а потоа ги дели на помали подкатегории како „метаболизам на јаглени хидрати“, што пак може да се подели на повеќе специфични подгрупи како што се „фосфорилација на инозитол и деривати“. Покрај нивната биолошка функција, хемиски својства и клеточна локација, гените имаат и други својства. На пример, гените можат да се класифицираат во групи засновани на нивната врска со другите гени, нивната поврзаност со болести или нивната интеракција со лекови или токсини. Базата на податоци за молекуларни потписи [15] и компаративна база на податоци за токсикогеномика [16] овозможуваат категоризирање на гените на различни начини.

Препознавање на моделот помеѓу регулираните гени

Кога регулираните гени се сортираат според тоа што се и што прават, може да се појават важни врски помеѓу различни гени [18]. На пример, може да добиете индикација дека одреден ген кодира протеин што создава ензим кој, пак, активира протеин кој регулира втор ген на нашата листа. Овој втор ген може да биде фактор на транскрипција, кој пак регулира друг наш ген кандидат. Набудувајќи ги овие вкрстени врски, можеме да претпоставиме дека ова се повеќе од случајни асоцијации и дека сите овие гени се на нашата листа бидејќи тие се дел од основниот биолошки процес. Од друга страна, гените кои се независни и се целосно случајно избрани, секако може да дадат впечаток дека се дел од заеднички процес, иако тоа не е случај.

Врските со причина и последица

Користење на обрасци за препознавање на регулирани гени

Заклучоци

Анализата на генската експресија дава нови информации за тоа како гените се однесуваат под различни услови. Во голема мера, техниките на микро-низа создаваат сигурни профили на изразување [24]. Врз основа на овие податоци, може да се изготват нови биолошки хипотези или да се проверат постојните хипотези. Сепак, обемот и комплексноста на овие експерименти честопати доведуваат до различни различни толкувања. Во многу случаи, анализата на податоците на изразните профили бара значително повеќе време и напор од оригиналниот експеримент за генерирање на податоците. Многу научници користат неколку статистички методи и прелиминарна анализа на податоци и се консултираат со биостатистичари или други експерти во областа на технологијата на микрорегулирање пред да ги објават резултатите од анализите за изразување на гени. Добра експериментална поставеност, адекватен број на биолошки реплики и повторени експерименти играат клучна улога во извршувањето на успешни анализи на генската експресија.