Анализа на експресија на гените кај смарагдно пепел (Agrilus planipennis) користејќи квантитативна реална

Резиме

Квантитативната PCR во реално време (qRT-PCR) е ефикасна алатка за дијагностицирање на нивото на mRNA во различни ткива на инсекти и развојни фази. Во овој извештај, ние ја демонстрираме употребата на qRT-PCR за да се утврдат нивоата на mRNA во различни ткива на ларвите и развојните фази на инвазивните видови инсекти, досадите на смарагд пепел.

Апстракт

Емералд пепел (ЕАБ, Agrilus planipennis) е егзотичен инвазивен штетник што уби милиони пепел (Fraxinus spp) во Северна Америка. ЕАБ продолжува рапидно да се шири и напаѓа пепелчиња од различна возраст, од фиданка до дрвја. Сепак, до денес, многу малку или воопшто нема молекуларно знаење за EAB. Ние сме заинтересирани за дешифрирање на молекуларната основа на физиолошките процеси во ткивото што му помагаат на ЕАБ во успешна колонизација на пепел. Во овој извештај, ние ја покажуваме ефективната употреба на квантитативна PCR во реално време (qRT-PCR) за да се испитаат нивоата на mRNA во различни фази на ларво ткиво (вклучувајќи масно црево и кутикула) и различни фази на развој (вклучувајќи 1 St -, 2 Nd -, 3 Rd, 4-ти стадиум, претпупаи и возрасни) од EAB. Како пример, генот на перитрофин (именуван овде, АП-ПЕРИ1) се користи како ген од интерес и пример за рибозомален протеин (АП-РП1) се користи како внатрешна контрола. Петрофините се важни компоненти на перитрофичната мембрана/матрицата (ПМ), што е обвивката на цревата на инсектите. Премиерот има различни функции како што се варење и механичка заштита на епителот на средното црево.

Протокол

Целосниот протокол со различните чекори прикажани на графиконот на слика 1. Индивидуалните чекори формираат дисекција, извлекување на РНК, синтеза на cDNA на првата низа и qRT-PCR се опишани подолу.

II. Екстракција на РНК (според протоколот на производителот за употреба на реагенс Тризол)

  1. За да започнете со извлекување на РНК, прво користете пластични толчници за хомогенизација на ткивата во Тризол со 1,5 милилитри Епендорф цевки. По хомогенизацијата, со реагенсот Тризол, донесете го вкупниот волумен на секој примерок до 1 ml.
  2. За фазите на развој, хомогенизирајте го целото животно во течен азот со толчник и малтер. Потоа, додадете 1 количина од хомогенатот (50 ug) на 1 ml Тризол.

  1. Инкубирајте ги примерочните цевки со 1 ml Тризол 15 минути на собна температура.
  2. По инкубацијата, додадете 200 μl хлороформ на секоја цевка. Веднаш по додавањето на хлороформ и енергично протресете ги цевките околу 15 секунди. Потоа држете ги цевките на собна температура уште 2-3 минути.
  3. Следно, центрифугирајте ги примероците на 12 000 xg за 15 минути на 2 ° C. По центрифугирањето, РНК е во водена фаза. Волуменот на водената фаза треба да биде 600 μl, или 60% од вкупниот волумен на Тризол.

  1. Внимателно отстранете ја само водената фаза. Присуството на супстанции под водната фаза ќе ја контаминира извлечената РНК. Потоа, пренесете ја водената фаза во соодветно обележана цевка од 1,5 ml Епендорф.
  2. За да се таложи РНК од водената фаза, измешајте 0,5 ml изопропил алкохол во секоја цевка. Инкубирајте ги примероците на собна температура 10 минути. По инкубација, центрифугирајте на 12 000 xg за 10 минути на 2 ° C.

  1. По центрифугирање, исфрлете го супернатантот од цевките. РНК се формира во гел-како пелети на дното на цевката. Пелетот измијте го со 75% етанол, додавајќи најмалку 1 ml 75% етанол на 1 ml Trizol. Мешајте со вител. Потоа центрифугирајте на 7500Xg 5 минути на 2 ° C.

  1. Отфрлете го супернатантот од цевките. Центрифугирајте повторно во мала центрифуга за маса за 1 минута. Отстранете го вишокот супернатантен материјал од цевката со внимателно пипетирање. Оставете ја цевката отворена и оставете да се исуши пелетот 5-10 минути. Бидете сигурни дека имате сув пелети бидејќи тоа значително ќе ја намали неговата растворливост.
  2. По сушењето на воздухот, пелетот во диетил пирокарбонат, или DEPC, пречистена вода. Количината на вода што се користи за повторно суспендирање на пелетот зависи од големината на пелетот. Користете 50 μl вода третирана со DEPC за мал топче или 100 μl за голем пелет. Оставете пелетот целосно да се раствори во вода третирана со ДЕПЦ со лизгање на врвот на пипетата неколку пати нагоре и надолу.
  3. Откако ќе се раствори пелетот, ставете го примерокот на 55 ° C 10 минути.
  4. Потоа измерете ја концентрацијата на секој примерок од РНК со спектрофотометар на нанодроп (2 μl од примерокот на РНК).
  5. Чувајте ги примероците на РНК на -80 ° C до понатамошна употреба.

III. Синтеза на cDNA од прва низа (според протоколот на производителот со комплет за синтеза на први нишки од SuperScript од Invitrogen.)

Дизајн на прајмер и одредување на референтниот ген

    Дизајн на прајмер со температура на топење (Tm) од 60 ° C и големина на производот од

100 б.п.

  • АП-ПЕРИ1 се користи како ген од интерес за овој експеримент. Потребен е референтен ген или систем на внатрешна контрола за подоцнежна анализа и нормализирање на податоците. Рибозомалниот протеин (AP-RP1) се користи како референтен ген за овој експеримент.
  • Подгответе 5um работни залихи на буквари што ќе се користат вклучувајќи го и вашиот референтен ген.

    • Подготовка на стандардите

    1. За да се пресмета ефикасноста на букварите, треба да се направат користени стандарди.
    2. Направете мешавина од cDNA од различните примероци што се тестираат.
    3. Направете 5X сериски разредувања за која било точка на графиконот. Четири разредувања треба да бидат доволни, но пет се препорачува.
    4. Волуменот варира во зависност од тоа колку поени и колку технички реплики се користат. Треба да биде доволно да се направи стандард за секој ген што се тестира со соодветниот референтен ген.

    1. Шаблонот за дизајн го покажува името на примерокот за секој бунар во плочката qRT-PCR. Запомнете дека постојат стандарди за секој ген и најмалку две технички реплики по примерок.

    Поставете ги параметрите на тркалото

    1. Вклучете ја машината qRT-PCR и внесете ги параметрите на тркалото. Параметрите на PCR за овој експеримент се како што следува:
      Чекор 1:
      • 1 циклус: 95 ° C 3 мин
      Чекор 2:
      • 40 циклуси: 95 ° C 15 сек., Проследено со 60 ° C 30 сек
        (По избор: вклучете ги следниве чекори за да ја одредите кривата на топење)
      Чекор 3:
      • 1 циклус: 95 ° C 1 мин
      Чекор 4:
      • 1 циклус: 55 ° C 1 мин
      Чекор 5:
      • 81 циклус: 55 ° С 30 сек

    Поставете плоча за машината CFX96 (BioRad)

    V. Шематски приказ на експериментот

    гените
    Илустрација 1: Табела за проток што ја покажува низата чекори за испитување на изразување на гени.

    пепел
    Слика 2: А) Дисекцијата на ЛАРВ ЕАБ покажува средно црево во средината. Б) изолирана средна црева на ларвите EAB

    пепел
    Слика 3: А) Средни релативни вредности на изразување (револуции) за генот перитрофин (AP-PERI1) во различни фази на ларво ткиво, вклучувајќи кутикула (Cu), средно црево (MG) и масно тело (FB). Специфичен EAB-рибозомски протеин (именуван овде, AP-RP1) беше искористен како внатрешна контрола за нормализирање на добиените податоци за генот од интерес, AP-PERI1. Б) Релативна промена на пати во AP-PERI1 во ларвите ткива. Ткивото на кутикулите покажа најмалку израз и затоа се користеше како примерок за калибратор (1X) (Пфафл, 2001).

    гените
    Слика 4: А) Средни релативни вредности на изразување (револуции) за генот на перитрофин (АП-ПЕРИ1) во различни развојни фази на ЕАБ, вклучувајќи фази на ларва (1, 2, 3 и 4), претпупа (PP) и возрасни (A). Како внатрешна контрола за нормализирање на добиените податоци за генот од интерес, AP-PERI1, се користеше EAB определен рибозомален протеин (AP-RP1). Б) Релативна промена на пати во AP-PERI1 во различни фази на развој. ПП примерокот покажа најниско ниво на нивоа на mRNA и затоа беше земен како калибратор (1X примерок).

    Квантитативната PCR во реално време (qRT-PCR) е ефикасна алатка за дијагностицирање на нивото на mRNA во различни ткива на инсекти и развојни фази. Понатаму qRT-PCR има претежно централен инструмент за потврдување на податоците генерирани од анализите на експресија на генот со голема пропусна моќ, како што се микрорежиците и новата генерација на RNA-Seq.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Вредноста на циклусите на праг (Ct) за секој примерок се добива во плочката qRT-PCR. За да се произведе стандардната крива, Ct вредноста добиена за секое разредување е исцртана наспроти дневникот на концентрацијата. Вредностите на Ct за експерименталните примероци потоа беа нацртани на оваа серија на разредување на стандардна крива. Целните количини се пресметани од одделни стандардни кривини за секој експеримент, т.е. се генерираат ткиво и израз на развој. Релативните вредности на изразување (вртежи) потоа беа утврдени со делење на количините на целната низа од интерес (во овој случај AP-PERI1) со количината добиена за системот за внатрешна контрола (AP-RP1). Значајно за пресметките, дневниците на REV за секој ген беа анализирани од ANOVA (Анализа на варијанса) користејќи ја PROC MIXED постапката од САС (Водич за корисници на Институтот САС/СТАТ, ВАЗИЈА 9.1). Значењето на изразот беше потребно на p Претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Откривање

    Не е прогласен конфликт на интереси.

    Признанија

    Ја препознаваме помошта дадена од Лурд Делта Арруета Антекера (Оддел за ентомологија, Државен универзитет во Охајо/OARDC, Вустер, ОХ) при поставување на експериментите. Му благодариме на д-р. Тереза ​​Полска (USDA, Шумски услуги, NRS) за испраќање примероци на ларви EAB. Помош обезбедено од д-р. Луис А Канас и Нурис М Акоста со поставувањето на микроскопот се ценети. Финансирањето за овој проект беше добиено од државни и федерални средства обезбедени од Центарот за истражување и развој на земјоделството во Охајо, Државниот универзитет во Охајо.