Ефект на чај катехин епигалокатехин галат врз енергетскиот метаболизам на глувчето - PDF Free

Германски институт за истражување на исхрана Потсдам - ​​Ребруке, Оддел за фармакологија Работна група Физиологија на енергетски метаболизам Ефект на чај катехин епигалокатехин галат врз енергетскиот метаболизам на глувчето Дисертација за добивање на докторска диплома (д-р. Ре.н.т.т.) На Факултетот за математика и природни науки на Универзитетот во Потсдам .-Научна исхрана Маика Фридрих родена на 1 ноември 1978 година, Магдебург Потсдам, февруари 2010 година

ефект

Ова дело е лиценцирано според договор за лиценца на Криејтив комонс: Атрибуција Нема комерцијална употреба Без адаптација 3.0 Германија За да ги видите условите на лиценцата, следете ја хиперврската: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/Објавено на Интернет на серверот за објавување на Универзитетот во Потсдам: URL http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2010/4815/ URN урнатика: nbn: de: kobv: 517-opus-48159 http: // nbn-резолуција .org/urn: nbn: de: kobv: 517-opus-48159

mrna MRP NaOH NEFA NMR pa PAS PC PCR PDB PDE PDHx PEPCK PIG-B PK гласник Рибонуклеинска киселина Мултимедицинска резистенција на протеини Натриум хидроксид не естерифицирана масна киселина нестеризирани масни киселини Нуклеарна магнетна резонанца постбазорптив периодична киселина борова реакција Пируват дехидрогеназа комплекс Фосфоенолпируват карбоксилаза Фенол-изоамил алкохол-гванидиниум изотиоцијанат-меркаптоетанол Пируват киназа PLA 2 Фосфолипаза А 2 Плин Перилипин ПО Палмитат оксидација pp после јадење Пероксизом видови-реактивно време-реактивен кислород-реакција-активен кислород-реакција-активен кислород-реакција-активна кислородна реакција Карбоксилаза СД Стандардна диета SGLT1 Натриум зависен транспортер на глукоза 1 SO оксидација на подлогата StK Метаболен кафез TG триглицерид TM сува материја UCP раздвојувачки протеин VO 2 Потрошувачка на кислород WAT бело масно ткиво СЗО Светска здравствена организација VII

Вовед Полифенолите се флавоноиди, кои пак се поделени на флаваноли и катехини. Катехините во зелениот чај сочинуваат до 30% од сувата материја. Тие се диференцираат на следниов начин: (Слика 1-2): епикатехин (ЕЦ), еликатехин галат (ЕКГ), епигалокатехин (EGC) и епигалокатехин галат (EGCG). Структурните разлики се јавуваат во бројот на хидроксилни групи и во присуство на галоил група. Со учество до 50% од вкупната содржина на катехини, EGCG е доминантен катехин во зелениот чај. Покрај катехините, зелениот чај содржи протеини (15%), влакна (26%), други јаглени хидрати (7%), липиди (7%), минерали (5%), аминокиселини (4%) и пигменти (2%) (Кабрера и сор., 2006). Сл. 1-2: Хемиска структура на главните компоненти на зелениот чај (Koo & Noh, 2007) Друга компонента на зелениот чај е кофеинот, кој сочинува приближно 3 6% (Јанг и Ландау, 2000). Чаша зелен чај содржи помеѓу 20 и 100 мг EGCG и 20 40 мг кофеин (Stangl et al., 2006; Khokhar & Magnusdottir, 2002). Различните чаеви катехини имаат различна биолошка активност, при што EGCG покажува најголема активност (Чен и сор., 1997). Од чајните катехини, тој има најголем број на хидроксилни групи на трите јаглеродни прстени кои се важни за формирање на водородни соединенија. Галоилната група содржана во молекулата EGCG исто така може да комуницира со други молекули, на пр. Влезете во радикали (Лиао, 2001). 14-ти

Во воведот, имаше посебен интерес за истрага на полифенолот EGCG, кој претежно се наоѓа во зелениот чај. Многу од ефектите опишани во литературата се забележани по долготрајна употреба. Не е јасно дали промените во долгорочните студии се предизвикани директно од EGCG или индиректно како резултат на намалување на маснотиите. Затоа, за истрагите спроведени овде беше избрано кратко или среднорочно траење на апликацијата, при што промените во составот на телото сè уште не беа јасно манифестирани. Целта на оваа работа беше детално да се испита влијанието на чајот полифенол EGCG врз енергијата и метаболизмот на подлогата по краткорочна и среднорочна примена. Глувчето е избрано како модел на истражување затоа што тој и луѓето се доста слични во однос на биорасположивоста на EGCG. Целта беше да се открие какво влијание има EGCG врз различните физиолошки параметри во моделот на глушец по краткорочна и среднорочна примена. Енергијата и метаболизмот на мастите по краткорочна и среднорочна примена треба да се испитаат во однос на енергетскиот биланс и на молекуларно ниво со цел да се откријат можните механизми. 23

Материјал и методи Таб. 2-2: Извори на хранливи материи на полусинтетички диети со висок процент на маснотии Состојки [g/100 g] Експеримент 3 (види 2.2.3.3) Експеримент 4 (види 2.2.3.4) Казеин 1 20 18 Пченичен скроб 2 40 43 Сахароза 3 5 5 Маст од дланка 4 18 Масло од ленено семе 5 1 Масло од шафон 6 1 Пченкарно масло 7 17 Целулоза 8 11 7 Минерална смеса 9 5 5 Витаминска смеса 10 2 2 Вода, мл 30 30 Содржина на енергија [kj/g] 19,9 21,3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Постојано млеко Peiting GmbH, Landshut (86% сурови протеини) Kröner GmbH, Ibbenbüren/Westfahlen Nordzucker GmbH, Uelzen OTHÜNA, Ostthüringer Nahrungsmittelwerk Gera GmbH, Gera LARU Langensiep & Ruckebier GmbH, Bottbet Gomtbensht, Gomtbensbünten GmbH, Rosenberg Mineral-Trace Element Premix C1000 на 100 g: приближно 930 mg; П, 730 мг; Mg, 80 mg; Na, 440 mg; К, 710 мг; S, 170 mg; Cl, 360 mg; Fe, 20 mg; Mn, 10 mg; Zn, 3 mg; Cu, 800 mg; Ј, 40 мг; F, 400 mg; Се, 20 мг; Ко, 10 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) витамински премикс C1000 на 100 g: A, 0,45 mg; Холекалциферол, 1,13 мг; К 3, 1 мг; Тиамин, 2 mg; Рибофлавин, 2 mg; Б-6, 1,5 мг; Б-12, 3 мг; Ниацин, 5 mg; Пантотенска киселина, 5 mg, фолна киселина, 1 mg; Биотин, 20 мг; Холин хлорид, 100 mg; р-аминобензоична киселина, 10 mg; Инозитол, 10 mg; Е, 16,4 mg (Altromin Spezialfutter GmbH & Co. KG, Lage) 26

Материјал и методи 2.2.3 Дизајн на тест Со цел да се испитаат ефектите на EGCG, извршени се неколку тестови на животни со различни дизајни на студии. 2.2.3.1 Експеримент 1: Истражувања за краткорочно и среднорочно влијание на EGCG врз параметрите на енергетскиот метаболизам Во овој експеримент, треба да се испитаат краткорочните и среднорочните ефекти на примената на EGCG врз параметрите на енергетскиот метаболизам, особено на енергетскиот метаболизам. За оваа цел беа извршени два парцијални теста (Слика 2-2). Сл. 2-2: Временски тек на студии врз животни извршени за да се испита ефектот на EGCG врз параметрите на енергетскиот метаболизам кај глувците по кратка (1А) и среднорочна (1Б) апликација NMR Одредување на составот на телото со помош на спектроскопија на нуклеарна магнетна резонанца (NMR) (види 2.2.5) ITK индиректна калориметрија на животни; Одредување на параметрите на обртот на енергија (види 2.2.6) Оксидација на подлогата SO со помош на стабилни изотопи (види 2.2.7.1) StK t метаболизам во кафез убивање

Материјал и методи Сл. 2-4: 13-акумулација на Ц во избрани органи и ткива, како и издишаниот воздух кај глувците по преминот од стандардна диета (СД) во диета со многу маснотии (ХФД) што содржи 13 С DOB = Delta over Baseline EGCG тест Прелиминарниот тест резултираше со период на хранење од една недела за да се утврди инкорпорирање на 13 C во зависност од апликацијата EGCG. И тука глувците биле префрлени од SD во полусинтетички HFD, кој содржел пченкарно масло како единствен извор на маснотии (Слика 2-5). Основите се опишани во точка 2.2.7.2. EGCG беше администриран со храна (групи: почетна група (SD), контрола, 0,25%, 0,50% EGCG (HFD), n = 8). Сл. 2-5: Дизајн на тест за испитување на 13 C-инкорпорирање на диететски обележани триглицериди кај глувци NMR определување на составот на телото со помош на NMR-спектроскопија (види 2.2.5) Пример за респираторен гас за одредување на збогатување на 13 C со помош на IRMS (види 2.2.7.1) убие 30

Сет од 30 l/h. За одржување на постојана температура на околината (22 C), кафезите за дишење беа сместени во климатски ормани (V (tsch Industrietechnik, Reiskirchen-Lindenstruth). Пропорцијата на потрошувачката на О 2 (VO 2) и производството на CO 2 (VCO 2) се утврдени за секое животно во 6-минутен интервал. Според Eq. 2-2 (Френц, 1999). На глувците им била дадена храната во 16 часот со цел да се испита влијанието на EGCG и во постпсорптивни и постпрандијални услови. Во краткотрајната студија, хранењето беше комбинирано со орална апликација EGCG. 36

Материјал и методи Плочата се пипетира, се додаваат 150 µl на ензимскиот реагенс (RGT), се меша и се центрифугира. По време на инкубација од 10 минути на собна температура, изумирањето на примероците и стандардот беа измерени со празно место на реагенсот (вода) на 500 nm (Power Wave 340, BioTek Instruments GmbH, Bad Friedrichshall). Концентрацијата на холестерол во плазматските примероци е пресметана со користење на равенката за линеарна регресија на стандардната серија (Ек. 2-19). ymxn (Eq. 2-19) yxmn пад на концентрацијата на истребување на пресекот на права линија со y-оската 2.5.1.2 Слободни масни киселини Принцип Квантитативното одредување на слободните масни киселини во плазмата е извршено со NEFA-C тест (Wako Chemicals GmbH, Neuss) . Принципот на реакција е прикажан во следните равенки (Подел. 2-20 до Ек. 2-22). R COOH Ацил CoA Синтетаза ATP CoA SH Ацил CoA AMP PP i (Eq. 2-20) Ацил CoA O Ацил CoA оксидаза 2 2,3 транс Ендол CoA H2O2 (Eq. 2-21) Пероксидаза 2 H2 O2 4 аминофена зона MEHA хинон имин 4 H2O (Eq. 2-22) R-COOH ATP CoA-SH AMP PP i масни киселини аденозин трифосфат коензим А аденозин монофосфат фосфорна киселина 50

Материјали и методи ΔE празно (E2 E1) празно 2 (E3 E2) празно (Eq. 2-29) ΔE примерок (E2 E1) примерок 2 (E3 E2) примерок (eq. 2-30) Прво, разликата помеѓу трите Мерења на истребување (E1-E3) утврдени за примерокот и празните вредности (Eq. 2-29 до Eq. 2-30). Ова се користи за пресметување на разликата помеѓу примерокот и празната вредност (Еквил. 2-31). ΔE ΔE примерок ΔE празна вредност (Eq. 2-31) Потоа, концентрацијата е пресметана со помош на дебелината на слојот според следната равенка (Eq. 2-32): c β HB V MW β HB ε dv 1000 ΔE g/l (Eq. 2 -32) V конечен волумен (ml) MW молекуларна тежина -HB (104,1 g/mol) коефициент на истребување на формазан на 492 nm (19,9 l mol -1 cm -1) d дебелина на слојот (1 cm) v волумен на примерокот (ml) Конечно пресметаните концентрации на трикратните примероци биле просечни и се земало во предвид разредувањето од 1: 2 на плазматските примероци. 2.5.2 Определување на триглицериди во црниот дроб За да се утврди содржината на триглицериди во црниот дроб, триглицеридите први беа извлечени со HB пуфер. Извлечените триглицериди потоа може да се одредат со Комплет за определување триглицерид (Сигма-Олдрих Чеми ГмбХ, Тауфкирхен). 55

Материјал и методи TE пуфер Tris-HCl EDTA автоклавиран, односно 2 O прилагодуваат pH 8,0, автоклав 10 mm 1 mm 10xMOPS МОПС натриум ацетат EDTA pH 5,5 7,0; автоклав (промена на бојата во жолто) 200 mm 50 mm 10 mm 1xMOPS - пуфер за електрофореза 10xMOPS рекламирање 1 l со автоклавен dh 2 O 100 ml денар за одземјување 10xMOPS 100 μl 37% формалдехид 175 μl 50% формамид 500 μl и 1 ml со автоклав dh 2 O пуфер глицерол 500 μl автоклави dh 2 O 400 μl 10xMOPS 100 μl шпатула врв бромофенол сино етидиум бромид разредување 0,1% етидиум бромид 50 μl автоклави dh 2 O 950 μl 2.6.4 Прочистување на РНК со употреба на варење на ДНаза Со цел да се минимизира можната контаминација на РНК со геномска ДНК, Екстракти од РНК прочистени со комплетот без ДНК ТУРБО (Ambion/Applied Biosystems, Darmstadt). За таа цел, приближно 10 μl РНК (помеѓу 5-40 μg РНК) се мешаа со 7 μл вода третирана со DEPC, 2 μл пуфер Turbo DNase и 1 μl DNase за 30 минути на 37 C во термички циклур (Peltier Thermal Cycler PTC-200, MJ Research Inc., Валтем, м-р, САД). Потоа, на 65 беа додадени 2 μl реагенс за инактивација на ДНаза

Материјал и методи Таб. 2-12: ЦДНА количина на серија за разредување за одредување на концентрација на ефикасност на прајмерот 1 0,05 концентрација 2 0,20 концентрација 3 1 концентрација 4 5 концентрација 5 20 концентрација 6 50 ЦДНА количина [ng] Графички приказ на Логаритамските почетни концентрации на сериите за разредување (x-оска) наспроти вредностите на CT (y-оска) резултираа во регресивна линија, чие зголемување беше искористено за пресметување на ефикасноста (Ек. 2-40, Ваерман и сор., 2004). Ефикасноста беше обично 85-100%. E 10 1/m 1 (Eq. 2-40) Релативната квантификација на генскиот израз се случи по нормализирање на референтен ген (овде: 18SrRNA, Eq. 2-41). ΔC T C T ('целен ген) C T (18SrRNA) (Еквил. 2-41) Пресметаната вредност на Т Т потоа се одзема од измислената вредност 36 (Еквил. 2-42). Се претпоставува дека со C C вредност од 36, не се случува засилување на 18SrRNA затоа што условите на реакција (на пр. Концентрации на буквар, концентрација на MgCl 2) веќе не се оптимални на крајот од PCR. ΔΔC 36 T ΔC T (Eq. 2-42) Експоненцијалните вредности на C T се претворени во линеарна форма со зголемување на моќноста на основата 2 (Eq. 2-43). Релативна експресија на гени 2 C T (Рамномер. 2-43) 72