Геноми
Јирген Маркл
12 Институт за молекуларна физиологија, Универзитет Јоханес Гутенберг, Мајнц, Германија
Давид Садава
13 Центар за наука Кек, Кларемонт, Калифорнија, САД
Дејвид М. Хилис
14 Универзитет во Тексас во Остин, Остин, ТХ, САД
Х. Крег Хелер
15 Универзитет Стенфорд, Стенфорд, Калифорнија, САД
Сали Д. Хакер
16 Државен универзитет во Орегон, Корвалис, ОР, САД
Андреас Хелд
Биргит Јарош
7 Jarsoch Text, Ахен, Северна Рајна-Вестфалија Германија
Лотар Зајдлер
Моника Нихаус-Остерлох
Ева Сикст
10 Минхен, Баерн Германија
Матијас Делбрик
Истражување на фасцинација: Проект за геном на кучиња
Домашното куче Canis lupus familiaris, беше припитомено од страна на луѓето пред околу 15 000 години. Иако постојат многу различни сорти на волци, тие се доста слични, но тоа не е случај со „најдобриот пријател на човекот“. Федерациската интернационална федерација (FCI), најголемата светска организација за чадори за одгледувачи на кучиња, признава над 300 раси на кучиња. Генетичарите претпоставуваат дека има околу 100 вистински раси на кучиња, а останатите се сорти. Не само што расите на кучиња изгледаат доста различни, туку и се разликуваат многу во висина. На пример, просечната чивава тежи само 1,5 кг, додека шкотскиот пес 70 кг. Ниту еден друг цицач не покажува толку голема фенотипска варијабилност. Исто така, постојат стотици генетски болести кај кучињата, а многу од нив имаат свои колеги кај луѓето. Проектот за геном на кучиња започна кон крајот на 90-тите години за да открие кои гени се одговорни за генетската варијабилност и врските помеѓу гените и болестите.
Истражување на фасцинација: Проект за геном на кучиња
Домашното куче Canis lupus familiaris, беше припитомено од страна на луѓето пред околу 15 000 години. Иако постојат многу различни сорти на волци, тие се доста слични, но тоа не е случај со „најдобриот пријател на човекот“. Федерациската интернационална федерација (FCI), најголемата светска организација за чадори за одгледувачи на кучиња, признава над 300 раси на кучиња. Генетичарите претпоставуваат дека има околу 100 вистински раси на кучиња, а останатите се сорти. Не само што расите на кучиња изгледаат доста различни, туку и се разликуваат многу во висина. На пример, просечната чивава тежи само 1,5 кг, додека шкотскиот пес 70 кг. Ниту еден друг цицач не покажува толку голема фенотипска варијабилност. Исто така, постојат стотици генетски болести кај кучињата, а многу од нив имаат свои колеги кај луѓето. Проектот за геном на кучиња започна кон крајот на 90-тите години на минатиот век за да открие кои гени се одговорни за генетската варијабилност и како гените и болестите се поврзани.
Првите две кучиња на кои геномите им беа целосно разредени, беа боксер и пудлица. ДНК на кучешкиот геном се состои од 2,8 милијарди базни парови во 39 пара хромозоми. Содржи 19.000 гени кои кодираат протеини, од кои повеќето имаат пандан на други цицачи, вклучувајќи ги и луѓето. Користејќи ја целосната секвенца на геномот, тие започнаа да мапираат генетски маркери - специфични кратки ДНК секвенци - на одредени позиции во геномот кои се разликуваат кај одделни кучиња или кај раси на кучиња.
Генетски маркери служат за локализирање (и со тоа идентификување) на гени кои контролираат одредени карактеристики. На пример, Елејн Острандер и нејзината истражувачка група проучуваат португалски кучиња за вода за да идентификуваат гени кои ја контролираат големината на телото. Отстранувањето на клетките за изолација на ДНК беше релативно лесно: истрчавте памук преку внатрешноста на образот. Генот за инсулин-фактор на раст 1 (IGF-1) се покажа како важен за одредување на висината: големите раси имаат алел што го кодира активниот IGF-1, додека малите раси имаат алел носат алел за помалку активен IGF-1.
Како што се очекуваше, некои научници основаа компании за тестирање на кучиња за генетски варијанти врз основа на ДНК и на тој начин да можат да ја потврдат „чистотата на расата“ на засегнатите сопственици на кучиња. Слично на тоа, секвенциониран е геномот на домашни мачки, диви мачки и разни големи видови мачки. Споредбите на овие животински геноми помагаат да се утврди еволутивната историја на различните редови на цицачи и исто така да се идентификуваат гените кои се одговорни за болести и форми на црти како што се јавуваат кај различните видови цицачи. Ваквите истражувања секако не се ограничени на цицачи, но постојат геномски проекти низ животинското царство, вклучувајќи растенија, габи, многу други еукариоти и бројни прокариоти.
Кое знаење го стекнавме со секвенционирање на геномите на животните?
Одговорите на ова прашање ќе ги најдете во „Експеримент: компаративна анализа на геномот на тигар“ во Сек. 17.1 и во „Истражување на фасцинацијата“ на крајот од ова поглавје.
Геномите сега можат многу брзо да се секвенцираат
Во Секвенционирање на геномот се одредува нуклеотидната низа на целиот геном на живо суштество. Кај прокариот кој има еден хромозом, секвенцата на геномот е континуирана низа на базни парови (bp). Во диплоид, сексуално размножувачки видови со повеќе автозоми и пар сексуални хромозоми (Дел 10.1007/978-3-662-58172-8_12 # Sec22), терминот „секвенциран геном“ обично се однесува на низата на сите бази во хаплоид Сет автозоми и двата пола хромозома (кај луѓе 22 + 2, кај кучиња 38 + 2).
Накратко
Геномите се секвенцираат во форма на кратки фрагменти кои се мапираат едни со други со помош на преклопувања.
Во функционалната геномика, информациите за редоследот се користат за да се утврдат функциите на различните делови на геномот.
Во компаративната геномика се споредуваат геномските низи на различни организми.
Со напредокот на технологијата за секвенционирање на ДНК, дојде до експлозија на генетски информации што научниците можат да ги користат на различни начини.
Може да се споредат геномите на различни видови за да се види како тие се разликуваат на ниво на ДНК. Оваа информација потоа може да се искористи за да се разберат еволутивните односи.
Може да се споредат низите на поединци во рамките на еден вид за да се идентификуваат мутациите што предизвикуваат посебни фенотипови.
Информациите за редоследот може да се користат за идентификување на гените за одредени типови на карактеристики, како што се гените поврзани со болести.
Може да се најде ДНК-секвенцата на гените кои кодираат протеини и секвенцата на аминокиселини на засегнатите протеини може да се извлече од ова, доколку ова сè уште не е познато.
Основната низа на краток ДНК фрагмент може брзо да се одреди
Способноста за секвенционирање на целиот геном на комплексен организам не беше ни разгледана пред 1986 година. Сепак, добитникот на Нобеловата награда Ренато Дулбеко и други научници тогаш сугерираа дека треба да се мобилизира научната заедница ширум светот за да се справи со редоследот на целиот човечки геном. Една од причините беше дека луѓето што го преживеале атомскиот бомбардирање во Јапонија за време на Втората светска војна и кои биле изложени на радијација треба да бидат прегледани за можна штета на ДНК. Меѓутоа, за да може да се утврдат промените во човечкиот геном, прво требаше да се знае неговата низа.
Така се финансираше со народни пари Проект за човечки геном започна, огромен потфат што беше успешно завршен во 2003 година - значително порано од очекуваното. Овие напори беа поддржани и надополнети од приватно финансирани групи. Проектот имаше корист од развојот на многу нови и вртоглави методи кои први беа применети за секвенционирање на помали геноми - од прокариоти и едноставно изградени еукариоти, како што се моделите на организми што веќе сте ги сретнале во претходните поглавја на оваа книга. Многу од овие методи се широко користени денес, вклучително и целосно нови методи специјално за секвенционирање на геномот. Методолошките случувања во овој сектор се во тек. Овие методи се надополнети со нови методи за проучување на фенотипната разновидност на протеини и метаболички производи во клетката. Основно барање беше и е драматичниот понатамошен развој на компјутерскиот хардвер и софтвер за да може да се справиме со огромните количини на податоци што се појавуваат.
Многу прокариоти имаат еден хромозом, додека еукариотите имаат многу хромозоми. Поради нивните различни големини, хромозомите можат лесно да се одделат едни од други. Се чини дека најискрената метода е да се започне со секвенционирање на хромозом на едниот крај и едноставно да се секвенцира целата молекула на ДНК, нуклеотид со нуклеотид. Задачата е донекаде поедноставена со фактот дека само една од двете нишки треба да се секвенцира, бидејќи другата е комплементарна. Погледнете ја низата
тогаш другата жичка мора да изгледа вака:
Сепак, дури и со денешните методи, секвенционирањето на ДНК молекула, која е долга милиони базни парови, од едниот до другиот крај не е ниту можна ниту неопходна. Со оваа стратегија, неколку илјади базни парови може да се секвенцираат одеднаш. Со цел да се одреди геномната секвенца, ДНК-нишката на хромозомот долга неколку сантиметри треба да се распадне на многу кратки ДНК-фрагменти, а потоа илјадници такви фрагменти да бидат секвенционирани истовремено.
Во 1970-тите, Фредерик Сангер и неговите соработници измислија метод со кој ДНК може да се секвенцира со употреба на хемиски модифицирани нуклеотиди. Овие нуклеотиди првично биле дизајнирани да спречат поделба на клетките на ракот. Овој метод (или варијанта на истиот) бил искористен за да се одреди првата геномска низа на луѓе и неколку модели на организми. Сепак, според денешните стандарди, методот е релативно бавен, скап и трудоинтензивен. Во првата деценија на новиот милениум беа развиени побрзи и поевтини методи, честопати нарекувани Секвенционирање на висока пропусна моќ резимира. Овие методи користат минијатуризирана техника првично развиена за електронската индустрија и механизмите за репликација на ДНК, често во комбинација со Верижна реакција на полимераза (PCR).
Вкрстена референца
PCR може да се автоматизира; тоа е важен метод за секвенционирање на мали количини на ДНК. Детали за ПЦР може да се најдат во делот 10.1007/978-3-662-58172-8_13 # Sec23.
Методите за секвенционирање на висока пропусна моќ, исто така, сумирани под поимот Секвенционирање на следната генерација (NGS), брзо се подобруваат. Еден од многуте пристапи е опишан овде и е прикажан на слика 17.1. Прво, ДНК-фрагментите се подготвени за секвенционирање со врзување на нив со цврста подлога и засилување на ДНК со PCR (слика 17.1 а):
Голема молекула на ДНК е разделена на кратки фрагменти од по околу 100 bp. Ова може да се направи физички со создавање на механички сили на смолкнување кои ја разбиваат ДНК. Или се користат ензими кои ги хидролизираат фосфодистерските врски помеѓу нуклеотидите во ДНК 'рбетот во одредени интервали.
ДНК се денатурира со топлина, кршејќи ги водородните врски што ги држат двете нишки заедно. Секоја единствена жичка тогаш делува како образец за синтеза на нова, комплементарна ДНК.
Краток синтетички олигонуклеотиди се прицврстени на краевите на секој фрагмент и тие се прицврстени на цврста подлога.
ДНК-фрагментите се засилуваат со PCR. Се користат буквари кои се комплементарни на синтетичките олигонуклеотиди на краевите на одделните фрагменти на ДНК. Бидејќи околу 1000 копии на ДНК се прикачени на секоја позиција, ново додадените нуклеотиди можат лесно да се откријат за време на чекорите на секвенционирање.