Хиперхомоцистинемија и репродуктивна патологија Повторно изведена

хиперхомоцистинемија и репродуктивна патологија

Веацеслав Мошин, Алина Хотинеану, Адријан Крежу, Витали Скурту, Јулијана Холбан

Напис објавен во „Билтен за перинататологија“ од Реп. Молдавија, во 2014 година, бр. 1 (61)

Хиперхомоцистинемијата ја дефинира состојбата во која концентрациите на не-протеинската аминокиселина - хомоцистеин - ги надминуваат нормалните граници. Мутациите во гените на циклусот на фолна киселина (MTHFR, MTR, MTRR) даваат голем придонес, особено заедно со диета без витамини, особено од комплексот Б. Во моментов, хиперхомоцистинемијата е фактор на ризик за компликации во бременоста, како на пр.: руптура на плацентата, прееклампсија, дефекти на невралната туба, ограничувања на интраутериниот раст, спонтани абортуси. Во врска со овие, хомоцистеин е токсичен за крвните садови и може да иницира каскада на васкуларни компликации, вклучително и формирање на тромб. Генетското тестирање на пациентите ќе овозможи проценка на ризикот од хиперхомоцистаинемија и тромбоза, со индикација за соодветен третман и следење на бременоста.

хиперхомоцистинемија

Хомоцистеин (Hcy) е сулфур што содржи не-протеинска аминокиселина, отсуствува во природната исхрана и метаболички интермедијар при реакција на трансмилација и транссулфуризација - важни реакции при нормален раст на клетките, функција и диференцијација [8]. Во крвната плазма Hcy се наоѓа во различни форми: 70% од вкупниот хомоцистеин (tHcy) циркулира во протеин-врзана форма преку дисулфидни интеракции (главно албумин) [19]; околу 25% се наоѓаат во форма на димери на хомоцистеин, а остатокот (5%) - поврзани со други тиоли, вклучувајќи цистеин, намален Hcy и оксидиран [22].

Нивото на плазма Hcy се зголемува со возраста како резултат на метаболичкиот пад на Hcy во бубрезите. Womenените имаат пониско ниво на Hcy од мажите, делумно како резултат на влијанието на половите хормони (естроген и прогестерон) и менструацијата [20].

Под оптимални физиолошки услови количината на Hcy на клеточно ниво се регулира со два алтернативни метаболички патека: неповратна деградација со транссулфуризација или реметилација со формирање на метионин [3]. Транссулфуризацијата, која се јавува особено во црниот дроб и бубрезите, се состои во кондензација на Hcy со серин што резултира во цистатионин со учество на ензимот цистатинин-β-синтаза и витамин Б6 како кофактор. Во следниот чекор, цистацин-γ-лиаза го деградира цистатионинот во цистеин и α-кетобутират. Цистеинот се оксидира во атомот на сулфур и формира неоргански сулфат излачуван во урината [3]. Од друга страна, цистеинот е претходник на глутатион - антиоксиданс неопходен во детоксикацијата на ксенобиотиците.

Алтернативно, Hcγ се реметилира во метионин со употреба на метил-5-метилтетрахидрофолат (5-метилTHF) или донатор на бетаин [16]. На овој начин метаболизмот на Hcy е тесно поврзан со фолатен циклус: ензимот метионин синтаза (MTR) го катализира трансферот на метил групата од 5-метилTHF во Hcy со формирање на метионин и THF (тетрахидрофолат), реакција што се одвива во сите клетки, освен во еритроцитите. За MTR е потребен кофактор кобаламин (Cbl), а комплексот формиран Cbl (I) MTR ја врзува метил групата што резултира во methylCbl (III) MTR. По трансферот, Cbl (I) MTR се реформира и може да прифати друга метилна група. Во исто време, кобаламинот е малку оксидиран во форма Cbl (II), а комплексот Cbl (II) MTR станува неактивен. Друг ензим - метионин синтаза редуктаза (MTRR) - има функција на повторно активирање на комплексот Cbl (II) MTR со редуктивна метилација [14].

Последователно, конверзијата на THF во 5,10-метилен THF е катализирана од ензимот MTHFD1 и останува на ензимот да ја врати метил групата во Hcy реметилација. MTHFR што го намалува 5,10-метилен THF на 5-метил THF, а кофактор е витамин Б2 (рибофлавин).

Слика 1. Метаболизам на хомоцистеин: патека на метионин реметилација и пат на транссулфуризација со формирање производи како цистеин и сулфат

Хиперхомоцистинемија (HHcy)

HHcy е последица на недостаток на ензими и/или хранливи недостатоци на витамини кои го попречуваат нормалниот метаболизам на метионин и/или Hcy. Зголемувањето на концентрацијата на екстрацелуларниот Hcy е токсично за клетките и ткивата и може да иницира каскада на васкуларни компликации [25]. Нормалните граници на Hcy се помеѓу 5 и 15 μM [11]. Повисоките вредности се поврзани со формите: средно (15-30 μM), умерено (30-100 μM) и сериозно (> 100 μM) на HHcy [12]. Постои комплексна интеракција помеѓу генетските, метаболичките и факторите на животната средина за да се задржи нивото на хомоцистеин во нормални граници. Промени во фактор или комбинации на фактори може да го зголемат нивото на tHcy (тотален хомоцистеин). Според Стид [25], биле изучувани 4 услови кои го објаснуваат развојот на HHcy: 1) диета богата со метионин; 2) недостаток на витамин (Б12, Б6 и фолна киселина);
3) бубрежна дисфункција; 4) генетски абнормалности (во гените MTHFR, MTR, MTRR, CBS).

Слика 2. Фактори на хиперхомоцистинемија (HHcy): 4 патишта за акумулација на хомоцистеин

Ајде да ги испитаме подетално:

1) Половина од количината на метионин добиена преку внесувањето храна се претвора во Hcy [7]. Студиите врз животни сугерираат дека диетата богата со метионин во присуство на витамини Б6, Б12 и дефицит на фолна киселина може да го зголеми ризикот од атеросклероза и корорнарна васкуларна болест, додека диетата богата со растителна храна и овошје го одржува нивото на Hcy во нормални граници [1].

2) Кофактори добиени од витамини од Б-комплекс (Б2, Б6, Б9, Б12) учествуваат во ензимски реакции кои го регулираат метаболизмот на Hcy. Неколку студии покажуваат дека лицата со хиперхомоцистинемија имаат несоодветни концентрации на еден или повеќе ензимски кофактори [23]. И концентрацијата на Hcy е обратно пропорционална на плазматската концентрација на фолати, витамин Б12 и Б6 [10]. Фолната киселина (растворлива форма на витамин Б9) е потребна при клеточна делба и диференцијација, особено за време на бременоста. Дериватите на фолна киселина се донатори на моно-карбонски единици за синтеза на пурини и пиримидини, компоненти на ДНК и РНК, и со клонирање на металната група - учествува во епигенетска регулација.

3) Бубрезите претставуваат главно место на метаболизмот на Hcy кои ги поседуваат 3 ензими: MTR, CBS и цистацин-γ-лиаза [9]. Бубрежната дисфункција е придружена со зголемување на нивото на tHcy, а студиите на Арнадотир покажуваат обратна пропорционална врска помеѓу измерената стапка на гломеруларна филтрација и нивото на tHcy.

4) Генетските абнормалности во ензимите на метаболизмот на Hcy може да предизвикаат зголемување на концентрацијата на tHcy, а сериозноста на промените зависи од местото на генската мутација [25]. Најприфатениот полиморфизам поврзан со варијабилноста на Hcy е 677C> T во генот MTHFR кој го заменува Ала во Вал во ензимскиот состав. Канг и сор. идентификуваше варијанта на ензимот MTHFR карактеризиран со мала активност и „термолабилност“ [13]. Ензимската активност во случај на хетерозиготна КТ и хомозиготна ТТ генотипа е намалена за 35% и 70%, соодветно [25], а термолабилната форма е генетски маркер со умерен HHc и кај субјекти со генотип 677TT (3). Во исто време, оваа асоцијација се забележува само истовремено со несоодветни концентрации на фолати. Студиите на Гинтлер (1999) покажаа во моделот E.coli дека слабеењето на врзувањето на FAD е одговорно за намалување на ензимската активност, а заштитната улога од загубата на FAD се игра дури и со фолација [6].

Полиморфизмот на 1298A> C на генот MTHFR се состои во размена на Глу со Ала. Релевантно е дека ниту хомозиготниот, ниту хетерозиготниот статус на полиморфизмот не го менува плазматското ниво на Hcy [15]. Сепак, статусот на хетерозиготно соединение за C677T и A1298C е поврзан со намалена ензимска активност, високи нивоа на Hcy и ниски концентрации на фолати во плазмата [5].

Во полиморфизмот 66A> G на генот MTRR, изолеуцинот е заменет со метионин. Некои студии го пријавуваат овој полиморфизам како фактор на ризик за ДТН (дефекти на невралната туба) [21].

Хомоцистеин и кардиоваскуларни заболувања

Првиот доказ за потенцијалните негативни ефекти на Hcy врз васкуларниот wallид беше пријавен од МекКали во 1969 година [18]. Слични васкуларни лезии се пронајдени кај 2 пациенти со тешка HHcy поради вродени грешки во метаболизмот на Hcy, а „Теоријата на хомоцистеин“ претпоставува дека Hcy и неговите деривати се токсични за крвните садови. Од друга страна, резултатите од мета-анализите опфатени 24100 испитаници покажуваат дека терапијата за нормализација на хомоцистеин не го намалува ризикот од миокарден и церебрален инфаркт, што се објаснува со фактот дека овие тестови биле засновани на рецепт на фолна киселина [17]. Дополнувањето со терапија со фолати е корисно од една страна, но антагонистичкиот ефект е да се забрза пролиферацијата и воспалението - основните процеси во формирањето на атеросклеротична плака, главно се должи на улогата на метаболизмот на фолатите за да се обезбедат моно-јаглеродни единици за синтеза на пурин и пиримидиин во структурата на ДНК. РНК [4].

Неодамнешните студии опишуваат 3 патолошки механизми кои лежат во основата на васкуларните компликации предизвикани од Hcy: оксидативен стрес, ендотелијална дисфункција и васкуларно ремоделирање - интегрирани во „Токсичната тријада“ [4].

Слика 3. Токсична тријада: Патолошки механизми кои лежат во основата на васкуларни болести предизвикани од хомоцистеин.

Истражувањата сугерираат дека Hcy првенствено го напаѓа васкуларниот ендотел и иницира каскада на васкуларни компликации. Клинички опсервации и студии врз животни идентификуваа можни цели на Hcy: EC (ендотелијални клетки), VSMC (мускулни клетки), сврзни ткива, тромбоцити, фактори на коагулација, липиди, NO (азотен оксид) молекули на трансдукција на сигналот [25 ] Сепак, не постои унифицирана хипотеза што би објаснила како Hcy предизвикува оштетување на садот. Молекуларните и клеточните ефекти на HHcy се рефлектираат во Табела 1.

Табела 1. Механизми на хиперхомоцистинемија

Молекуларни ефекти на HHcy	Клеточните ефекти на HHcy
Намалување на производството на НЕ (азотен оксид)	Ендотелијална дисфункција
Намалување на количината на НЕ достапно	Нарушена вазорелаксација на ендотелијалните клетки
Оксидативен стрес	Митохондријална штета
Липидна пероксидација	Пролиферација на мазни мускулни клетки
воспаление	Деградација на екстрацелуларната матрица
коагулација	Оштетување на ДНК и РНК
Формирање на тромб	АПОПТОЗА

Материјали и методи: Истражувачката група се состоеше од пациенти од Медицинскиот центар со репродуктивни проблеми, вклучувајќи спонтани абортуси и повторливи спонтани абортуси. Геномската ДНК беше извлечена по специјализирани комплети (мини комплет за прочистување на геномска ДНК на целата крв, GeneJet, Fermentas) од леукоцити на периферната крв. Примероците од крв беа собрани во ЕДТА цевки за еднократна употреба со венипунктура.

За генетско тестирање на полиморфизмите MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTR A2756G и MTRR A66G, беа извршени реакции PCR/RFLP (реакција на полимеризација со вериги и полиморфизам со должина на фрагменти со ограничување) со специфични буквари земени од статиите 2 во литературата. 27.24]. Геномската ДНК беше засилена со помош на Dream Taq полимераза („Fermentas“, САД), во термоциклот „TProfessional Basic 96“ (Биометра, Германија). Условите на реакција се слични за сите полиморфизми, освен температурата на усогласување на прајмерот: 60,4 ° C за MTHFR C677T, 61 ° C за MTHFR A1298C, 58,4 ° C - MTR A2756G, 57,6 ° C - MTRR A66G, а стандардните услови на протокол се: денатурација почетно на 95 ° C - 3 минути, 33 циклуси: 94 ° C - 30 секунди, 57,6 - 61 ° C - 30 секунди, 72 ° C - 30 секунди и конечно издолжување на 72 ° C - 5 минути.

Ампликоните беа ограничени 3 часа на 37 ° C со ограничувачки ензими специфични за секој полиморфизам: Hinf I за MTHFR C677T, Mbo II за MTHFR A1298C, Hae III - MTR A2756G и Nde I - MTRR A66G.

Верификацијата на производите со ограничување беше извршена со електрофореза на гел PAAG (полиакриламид) со концентрација од 7,5% - под услови: 200 V за 3 часа. Гелот беше обоен со раствор на етидиум бромид. И резултатите беа прегледани во системот UV SOLO (Германија). Големините на фрагментот се рефлектираат на слика 4.

Слика 4. Електрофореграма на PCR/RFLP анализа на полиморфизми на генски фолатен циклус:

А) МТХ.FR C677T: М - маркер од 50 бп; 1 - ампликон (227 бп); 4 - 8 - нормална хомозиготна (205 бп); 2 - хетерозиготна (205, 129, 76 бп); 3 - хомозиготна после мутација (129, 76 бп);
Б) MTHFR A1298C: М - маркер од 50 бп; 1 - ампликон (163 бп); 4 - нормален хомозигот (56, 31, 30, 18 бп); 3, 5, 7 - хетерозиготна (84, 56, 31, 30, 18 бп); 2 - хомозиготна после мутација (84, 31, 30, 18 бп);
В) MTR A2756G: 2, 3, 5, 6, 9 - нормален хомозигот (421, 81 бп); 1, 4, 7, 8 - хетерозиготна (421, 269, 152, 81 бп); 10 - хомозиготна после мутација (269, 152, 81 бп);
Г) MTRR A66G: М - маркер од 50 бп; 2-ампликон (145 бп); 5, 6 - нормален хомозигот (145 бп); 4 - хетерозиготна (145, 123, 22 бп); 3 - хомозиготна после мутација (123, 22 бп).

Резултати и дискусии: Резултатите од генотипизацијата се претставени во дијаграмите 1 - 4. За проценка на вистинитоста на добиените резултати, користени се општоприфатените формули од статистичката варијација, со помош на програмата СИСА. Во овој контекст, фреквенциите на алелите и генотипските класи се пресметани според формулата на Харди-Вајнберг, а за споредување на фреквенциите на генотипите беше користен критериумот Пирсон - X 2 .

Дијаграм 1. Дистрибуција на фреквенција на генотипски класи според полиморфизам MTHFR C677T

Дијаграм 2. Распределба на фреквенцијата на генотипски класи според полиморфизам MTHFR A1298C

Дијаграм 3. Распределба на фреквенцијата на генотипски класи според полиморфизмот MTRR A66G

Дијаграм 4. Дистрибуција на фреквенција на генотипски класи според полиморфизам MTR A2756G

При споредување на фреквентната дистрибуција на набудуваните генотипови и оние теоретски очекувани со тестот Х 2, не е разјаснето статистички значајно отстапување од рамнотежата на Харди-Вајнберг за изучен полиморфизам: MTHFR C677T (X 2 = 0,575; p> 0,05); MTHFR A1298C (X 2 = 3,766; p = 0,052); MTR A2756G (X 2 = 2.332; p> 0,05); MTRR A66G (X 2 = 2,230; p> 0,05);

1) Хомоцистеин во големи количини има токсичен ефект врз ендотелот на крвните садови стимулирајќи го формирањето на тромби.

2) Хиперхомоцистаинемија е фактор на ризик за компликации во бременоста во различни периоди, вклучувајќи прееклампсија, прекинување на плацентата, ограничувања на интраутериниот раст и спонтани абортуси.

3) Генетско тестирање по мутации во гените на метаболизмот на хомоцистеин и фолна киселина овозможува проценка на ризик и пропишување на соодветен третман.