Хроничен протокол за глувци заразени со салмонела (превод на германски)

Резиме

Воспоставете модел на хронична бактериска инфекција на глувчето со постојана колонизација на Салмонела Тифимуриум во цревата 27 недели.

Апстракт

Моделот на глувче со бактериска инфекција е моќен модел за истражување во области како што се инфекција, воспаление, имунологија, трансдукција на сигнал и туморегенеза. Многу истражувачи го искористија колитисот предизвикан од Салмонела Тифимуриум за студии на раните фази на воспаление и инфекција. Сепак, малку извештаи за хронична инфекција се ин виво. Глувците со постојана егзистенција на Салмонела во гастроинтестиналниот тракт ни овозможуваат да ја истражиме долгорочната интеракција домаќин-бактери, трансдукција на сигнал и тумогенеза. Воспоставивме хронична бактериска инфекција модел на глувче со колонизација на Салмонела Тифимуриум во глувчето црево во текот на 6 месеци. За да се користи овој систем, неопходно е истражувачот да научи како да подготви бактериска култура и да ги извади животните. Ние детализираме методологија за подготовка на глувци од бактериска култура и гаважа. Ние исто така покажуваме како Салмонела открива постојаност во гастроинтестиналниот тракт. Генерално, овој протокол ќе им помогне на истражувачите со моделот на глувче со бактериска инфекција суштински да одговорат на биолошки и микробиолошки прашања.

Протокол

Овој протокол има три дела: бактериска култура, назогастрична цевка на глувчето и откривање на салмонела.

1. Состојба на раст на салмонела.

  1. Подгответе ја плочата за супа од салмонела Лурија-Бертани (LB), инкубирајте ја на 37 ° C преку ноќ.
  2. Изберете клон од плочата LB и ставете во 7 ml LB во цевка од 12 ml и тресете на 37 ° C околу 5 часа.
  3. Инокулирајте 50 ml LB со 0,05 ml стационарна фаза на културата и на 37 ° C без тресење околу 18 часа.
  4. Вртете бактериска култура преку ноќ на собна температура на 6000 вртежи во минута 10 минути за да ги суспендирате бактериите во HBSS со сооднос 100: 3 (LB: HBSS). На пример:
    Секоја 50 ml ЛБ-култура ќе биде суспендирана во 1,5 ml HBSS.
  5. За цевката за исхрана на животните, дополнително разредете ја бактериската култура во сооднос 1:10. На пример:
    Секоја 1,5 ml ЛБ-култура ќе биде суспендирана во 15 ml HBSS.

2. Модел на инфекција со салмонела *.

  1. Подгответе раствор на стрептомицин. На секој глушец ќе му се дадат 7,5 mg стрептомицин во 100 μl HBSS. На пример, подгответе вкупно 90 mg стрептомицин во 1,2 ml HBSS за 10 глувци. Секогаш малку повеќе волумен при подготовка на раствор на стрептомицин.
  2. Повлечете вода и храна 4 часа пред орален третман.
  3. Gavage глувци со стрептомицин со 7,5 mg стрептомицин (100 μl HBSS за контролни глувци). Фатете ја кожата преку рамото на глувчето цврсто со палецот и средниот прст, исправете ја главата и вратот со показалецот за да го направите хранопроводот исправен. Порамнете го врвот на иглата за хранење на покривот на устата и на десната страна од задниот дел на грлото, а потоа нежно поминете го во хранопроводот и внесете 100 μl раствор. Не треба да се чувствува никаков отпор.
  4. На 20 часа по третманот со стрептомицин, водата и храната повторно се повлекуваат пред глувците да бидат заразени со бактерии.
  5. Исплакнете го секој глушец третиран со 100 μl суспензија во HBSS или со стерилен HBSS (контрола) по пат на орален пат. Постапката на гаважа е иста како 2,3) глувци со стрептомицин.

* Студии врз животни беа спроведени со употреба на специфични женски глувци C57BL/6 без патогени (Таконик, Хадсон, )ујорк) стари 6-7 недели како што е опишано погоре 1. Протоколот беше одобрен од Комитетот за животински ресурси на Универзитетот во Рочестер (UCAR).

3. Откривање на салмонела во цревата.

  1. Соберете измет со глувчето (приближно 100 мг).
  2. Енергично пренесете примерок од столица во 1,5 микроцентрифугална цевка со 1 ml PBS и вител.
  3. Центрифугирајте 10 мин со 800 вртежи во минута. Пренесете го супернантот во чиста микроцентрифугална цевка.
  4. Центрифугирање при 6000 вртежи во минута за 5 мин. Супернатантот се отфрла и 200 μl PBS се додава на пелетите и се врти во вител.
  5. Намачкајте 200 μl PBS со шејкер за еднократна употреба на плоча BBL CHROMagar за да откриете салмонела. Салмонелата се појавува мавова (розова до виолетова, видете слика 1). Ако 200 μl дадат премногу колонии на плочата, користете 100 μl или 50 μl за лентата.

4. Резултати од репрезентацијата.

Ако протоколот е направен правилно, колонизацијата на салмонела тифимуриум може да се открие во цревата на глувчето повеќе од 6 месеци. Салмонелата може да се открие преку фекална култура во текот на 6 месеци (слика 1). Како што е типично за овој модел, губењето на телесната тежина и смртта се јавуваат во рок од 4 недели по инфекцијата. Во зависност од салмонеланите соеви што се користат за инфекција, некои глувци не можат да преживеат повеќе од 6 месеци.

хроничен
илустрација 1. Цревната салмонела во видовите салмонела се појавува во маво (розова до виолетова) боја, поради метаболички разлики во присуството на избрани хромогени. Другите бактерии се или инхибирани или произведуваат сино-зелени или безбојни колонии.

хроничен
Слика 2. Пропорции на преживување на глувци заразени со мултиран салмонела PhoP c, PhoP c Avra- и PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​4 недели (28 дена).

Табела 1. Тежини на телото на глувци заразени со салмонела 4 недели.

0 1 недела 2 недели 3 недели 4 недели
контрола 16,78 ± 1,05 16,91 ± 1,28 18,26 ± 1,23 19,31 ± 1,26 20,26 ± 1,15
PhoP в 16,89 ± 1,03 17,14 ± 1,19 17,43 ± 1,63 * 18,68 ± 1,78 20.05 ± 1.11
PhoP c Avra- 16,91 ± 1,12 16,96 ± 1,39 17,06 ± 2,14 ** 18,71 ± 2,18 20,15 ± 1,56
PhoP c AvrA-/AvrA + 16,94 ± 0,96 17,17 ± 1,02 17,63 ± 1,42 * 18,44 ± 2,03 20,09 ± 1,17

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

За да се користи овој систем, потребно е истражувачот да научи како да ги храни животните преку назогастрична цевка. Ние детално ја опишуваме методологијата за подготовка на бактериска култура и правиме глувци. Ние исто така покажуваме како да се следи постоењето на салмонела во гастроинтестиналниот тракт (ГИ тракт). Критичните чекори во овој протокол вклучуваат:

  1. Предтретман на стрептомицин: Предтретмент на стрептомицин може да се ослободи од некои комензална цревна флора и да ги направи глувците подложни на инфекција со салмонела 2.
  2. Цевка за хранење со салмонела: За почетник, цевката за хранење може да биде предизвик. Во одреден момент, назогастричната цевка не успева бидејќи растворот случајно се инјектира во дишните патишта и предизвикува смрт на глувчето.
  3. Постојана колонизација на бактерии: треба внимателно да се следат бактериите во гастроинтестиналниот тракт. Во прилог на фекална култура на глувче, содржината на додатокот може да се користи и за откривање на салмонела во плочите BBL CHROMagar. Соберете ја содржината на додатоците кога жртвувате глувци по инфекција со салмонела.

Ние ја тестиравме колонизацијата на салмонела кај глувци во различни концентрации: 1 x 10 3 единици за формирање колонија до 1 x 10 8 единици за формирање колонија (100 μl/глушец). На 1 x 6-10 октомври x 10 8 единици за формирање колонија, Салмонела беа во можност да колонизираат глувци. Затоа, врз основа на нашите претходни публикации 1, 5 и необјавените податоци, крајната концентрација на салмонела во овој раствор нема да се мери пред хранење со гастрична цевка.

Во оваа експериментална постапка имаме специфични женски глувци без патогени C57BL/6 (Таконик, Хадсон, NYујорк) стари 6-7 недели. Користените бактериски соеви вклучуваат салмонела тифимуриум, див тип на соеви ATCC14028s (WT-SL), непатоген салмонела мутант PhoP c3, PhoP c Avra ​​и PhoP c AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra ​​(табела 2). Користејќи го овој протокол, колонизацијата на салмонела тифимуриум во цревата на глувчето може да се открие повеќе од 6 месеци (слика 1). Инфекција со салмонела и воспаление мерено со набудување на изметот и тежината на момчињата. Кога беа собрани примероци од ткиво и крв, должината на цревата беше измерена како карактеристика на воспаление на цревата. Исто така, биле испитани тежината на слезината и црниот дроб. Цитокините на глувчето во серумот биле тестирани со ELISA5. Понатаму, биохемиски и молекуларни методи понатаму се користат за тестирање на промените во воспалителните цитокини и патолошките промени предизвикани од салмонела 5.

Типично, губење на тежината и смртта се јавуваат во рок од 4 недели по инфекцијата (Табела 1). После инфекција со салмонела, имаше значително губење на телесната тежина во групите на бактериска инфекција во споредба со контролната група без бактериски третман (* компјутерски заразен, 78% PhoP c Avra- или 70% PhoP c AvrA-/AvrA + може да опстане со Салмонела преживува во цревата. После акутната инфекција, сите преживеани сепак извршиле салмонела што може да се открие по инфекцијата 6 месеци по процедурата опишана во овој предлог. Откако глувците преживеаја 3 недели по инфекцијата, глувците добија телесна тежина и се случи помала смрт Покрај тоа, податоците за боење со имунофлуросценција, исто така, покажуваат инвазија на салмонела во цревната лигавица 27 недели по инфекцијата (слика 3). Овие податоци покажаа дека PhoP c, PhoP c Avra ​​или PhoP c AvrA/AvrA + може да се користи за моделот на хронична инфекција.

Глувците со фактор на отпорност на домаќинот Nramp1 +/+ се отпорни на инфекција со салмонела 3-6. Ц57/BL6 глувци со NRAMP биле неисправни во тековните студии. Откривме дека 90% глувци заразени со патоген салмонела, сој 14028, не можат да преживеат над 4 недели (податоците не се прикажани). Да се ​​разберат долгорочните ефекти на дивиот тип С. Може да се користат инфекции со тифимуриум, глувци со Nampr1 +/+.

Овој модел е воспоставен во лабораторија BSL-2. Нашиот протокол е одобрен од Комитетот за животински ресурси на Универзитетот во Рочестер (UCAR). Глувците кои се заразени со салмонела најверојатно ќе доживеат непријатност и стрес и стануваат помалку активни и бавно се движат. Нивното крзно може да се наежи и не им е дозволено да се хранат или да пијат нормално. Theивотните ќе бидат внимателно набудувани и ако има знаци на непријатност, како што не се амбулираат доволно добро за да се задржи хидратацијата и внесот на калории, ако глушецот покажа знаци дека има аспирирана течност или значително губење на тежината (10% или повеќе) 7 и не веднаш умре, глушецот беше хумано еутаназиран. Целиот персонал во лабораторијата ќе биде обучен за набудување на глувците според 8, 9.

Многу студии за предтретман на стрептомицин го искористија колитисот предизвикан од Салмонела тифимуриум за студии во раната фаза на инфекција 1,2,10. Сепак, само неколкумина пријавија за хронична инфекција кај моделот на глувче in vivo 11. Глувците со салмонела одржливо постоење во ГИ-тракт ни овозможуваат да истражиме долгорочна интеракција домаќин-бактери, трансдукција на сигнал и тумогенеза. Воспоставивме хронична бактериска инфекција модел на глувче со Salmonella typhimurium колонизирачки во глувчето црево во текот на 6 месеци. Овој модел може да се користи и за студии за патогенеза на E. coli и пробиотици. Генерално, овој протокол ќе им помогне на истражувачите со фундаментално важен модел на глушец да одговорат на биолошки и микробиолошки прашања.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.