Идентификација на метаболички активни бактерии во цревата на генералистот Spodoptera littoralis

Резиме

Активната бактериска заедница поврзана со цревата на Spodoptera littoralis се определи со стабилно истражување на изотопи (SIP), заедно со пиросеквенција. Со овој метод, идентификацијата на метаболички активните бактериски видови во заедницата беше спроведена со висока резолуција и точност.

Апстракт

Цревата на повеќето инсекти не се патогени населени со комплексни заедници на симбиотски бактерии. Во рамките на овие микробиолошки заедници е можно да се дојде или да се идентификуваат меѓусебни видови на бактерии. Забележано е дека последните служат повеќе функции на инсектот, помагајќи на тој начин во репродукција на инсекти, промовирајќи имунолошки одговор 2, производство на феромони 3, како и исхрана, вклучително и синтеза на есенцијални аминокиселини 4, меѓу другите.

Поради важноста на овие здруженија, направени се многу напори да се карактеризираат заедниците до одделните членови. Повеќето од овие напори биле или засновани на методи на одгледување или на генерирање на фрагменти од гени 16S rRNA кои биле секвенцирани за конечна идентификација. За жал, овие пристапи се препознаваат само што постојат во цревните бактериски видови и не даваат информации за метаболичката активност на микроорганизмите.

За да ги карактеризираме метаболички активните бактериски видови во цревата на инсект, користевме стабилна изотопска ingубопитност (SIP) in vivo со примена на 13 C-глукоза како универзален супстрат. Ова е ветувачка техника без култура која им овозможува на микробните педигре да бидат поврзани со нивната посебна метаболичка активност. Ова е можно со следење на стабилни изотопи обележани атоми од подлоги во микробиолошки биомаркери како ДНК и РНК 5. Вклучувањето на 13 C изотопи во ДНК ја зголемува густината на означената ДНК во споредба со неозначената (12 C). На крајот, ДНК или РНК обележана со 13 С е одделена од 12-С-неозначена слична 6 со ултрацентрифугирање со градиент на густина. Последователната молекуларна анализа на изотополозите на одделените нуклеински киселини ја воспоставува врската помеѓу метаболичката активност и идентитетот на видот.

Овде го презентираме протоколот што се користи за карактеризирање на метаболички активните бактерии во цревата на генералистот на инсектите (нашиот модел систем), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Филогенетската анализа на ДНК е направена со употреба на пиросеквенционирање, што овозможува висока резолуција и точност во идентификувањето на инсектите цревни бактериски заедници. Како главен супстрат во експериментите се користеше 13 C означена глукоза. Подлогата се храни со вештачка диета за инсектите.

Вовед

Со доаѓањето на технологиите за секвенционирање базирани на PCR, бројот на студии со користење на цревни биота од повеќе организми (т.е. луѓе, инсекти или морски организми) се зголемува. Покрај тоа, резултатите од изолацијата и одгледувањето на цревата што ги чуваат бактериите се независни отколку во минатото. Скоро 99% од бактериите не можат да бидат култивирани и тешко е да се симулираат условите на животната средина што преовладуваат во цревата 12. Со помош на PCR, 16S rRNA генски фрагменти (широко користен филогенетски ген на маркери меѓу бактериите) може селективно да се извлечат од мешан образец на ДНК на цревните бактериски заедници, секвенционирани, засилени, клонирани. Со оваа информација, корисникот може да ги идентификува бактериските видови откако ќе ги собере информациите за редоследот од јавните бази на податоци 13, 14. Како и да е, приодите за секвенционирање за да се опишат несоодветно бактериските заедници поради недостаток на информации за метаболичкиот придонес на секој вид во заедницата.

Тука користиме 13 C-глукоза за да ја „обележиме“ ДНК на метаболички активните бактериски видови во цревата. Гликозата е шеќер што го користат повеќето бактериски видови по раширената патека Ентер-Дудороф (ЕД), иако се познати исклучоци 20. Ова ја оправдува употребата на 13 Ц-глукоза како сигурна метаболичка сонда што ги поврзува метаболитите од интерес и Извор на јаглерод по утврдени патеки. Во зависност од научното прашање, други супстрати, т.е. 13 С-метан, 13 СО 2 или растенија под 13 СО 2 атмосфера, може да се користат за решавање на метаболичките активности.

Во овој момент, ние го презентираме протоколот што се користи во метаболичката карактеризација на бактериската заедница во цревата на генералистот на инсектите, имено S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Покрај тоа, методот беше поврзан со пиросеквенционирање, што за возврат овозможува идентификување на цревни бактериски заедници на инсекти со висока резолуција и точност. Како главен супстрат во експериментите се користеше 13 C означена глукоза.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

  1. Купете или набавете јајца од спојки Spodoptera littoralis од сопствениот оддел за одгледување. Одржувајте ги во стерилни садови Петри на собна температура (РТ) сè додека не се изведат.
  2. Подгответе го вештачкото хранење за одгледување инсекти како што следува:
    1. Потопете 500 гр мелен бел грав преку ноќ во 100 ml вода.
    2. Додадете 9,0 g аскорбинска киселина и 75 g агар на 1000 ml дестилирана H 2 O и потоа зовријте.
    3. Оставете ја смесата да се олади и кога ќе се зацврсти (во бела восочна цврста смеса) чувајте на 4 ° C до употреба.
  3. Пренесете ги штотуку изведените ларви во чиста пластична тегла и ставете ги на системот за вештачко хранење на 23-25 ​​° C под долг ден со режим на осветлување од 16 часа и темнина од 8 часа. Променете ја храната секој ден додека ларвите не ги поминат сите шест ларвови.

2. 13 Ц-означување на ДНК кај метаболички активни цревни бактерии

  1. Растворете 186,1 mg на целосно 13 C означена глукоза со дестилирана и деонизирана вода (ddH 2 O) и добро измешајте со 100 g вештачка храна за експериментот SIP. Обезбедете конечна концентрација на 13 C-глукоза од 10 mM при вештачко хранење. Ова ја имитира концентрацијата на глукоза in situ во цревата на ларвите S. littoralis на памучни растенија според Шао и сор. (доставено).
  2. Околу 9-15 здрави ларва од ларва од одгледување до стерилни пластични садови Петри (една ларва за сад Петри) со свежа 13 Ц-гликоза измешана со вештачка исхрана. Вештачка исхрана со иста количина на природна гликоза (12 C-глукоза) како што е опишано за хранење на контролната група.
  3. Обновувајте го вештачкото хранење често за време на периодот на инкубација (1 ден). Користете услови за одгледување како во чекор 1.3.
  4. Соберете девет ларви од секој третман за подоцнежна обработка (екстракција на ДНК). Секоја репликација е составена од три лица, правејќи најмалку три повторувања по третман.

4. Екстракција и засилување на ДНК

6. Карактеризација на ДНК со пиросеквенција

7. Анализа на податоци со пиросеквенционирање

  1. Анализирајте ги сегментите на сурова низа генерирани од пиросеквенционирањето 454 со помош на „Квантитативен увид во микробиолошката екологија“, цевковод софтвер QIIME 26. Обработката направете ја на следниов начин:
    1. Прво конвертирајте ја датотеката SFF генерирана од 454 во FASTA, QUAL и Flowgram датотеки со process_sff.py скрипта.
    2. Потврдете ја датотеката за мапирање (врз основа на check_id_map.py) и додели мултиплекс чита на биолошки семиња со split_libraries.py Скрипта. Исечете ги неквалитетните краеви со големина на лизгачки прозорец од 50 и просечен квалитет на отсекување од 25, дури и елиминирајте ги двосмислените кратки низи (должина на претплата е задолжителна. Ве молиме препорачајте ДАВАЕ до вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    По ултрацентрифугирање, откако ќе се потврди количината на ДНК одделена во секоја фракција и ќе се изврши мерење на густината, нацртајте ја просечната густина на дел во g/ml над бројот на фракцијата за да се утврди правилното формирање на наклонот во цевките, што обично вклучува опсег на потврда на густина од 1,690 (за дел 12 или 11) до 1,760 g/ml g/ml (за дел 1). Квантитативната пиросеквенцијација се изведува директно на репрезентативниот градиент SIP за да се открие видот на линијата и релативното изобилство (Слика 2) ) Тука ги распоредивме тешките фракции и од модифицираниот примерок од 13 C-глукоза и од неозначената контрола што служеше за профилирање на активни популации во заедницата. После секвенционирање, генерирани се вкупно 120.045 читања со висок квалитет со просечна должина од 404 нуклеотиди. Пиросеквенцирачкиот профил покажа зголемена фреквенција на одредени видови, вклучувајќи Enterococcus и Pantoea во означениот примерок (ДНК означен со 13 C, Сл. 3) во споредба со контролната група (12 Ц Контролна ДНК, Слика 3). Оттука, бактериите треба да се сметаат за метаболички активни и заслужуваат дополнителна студија.

    бактерии
    1. 13 експеримент за хранење со Ц-гликоза, екстракција на ДНК и PCR засилување на генот 16S rRNA (A) 13 C-глукозно модифицирано вештачко хранење консумирано од ларвите Spodoptera littoralis. (Б) Домородци Гликозата (12 C-гликоза) се претвори во вештачко хранење на ларви од иста група инсекти (А) користени што служат како потрошена контрола . (C) Типичен екстракт од метагеном ДНК од цревно ткиво на ларви во групата за третман на 13 Ц-гликоза и 12 во групата за контрола на Ц-гликоза. Три биолошки реплики (ленти 1, 2 и 3) се вклучени во секоја група. М се залага за 1 кб ДНК маркер. (Г) ПЦР засилување со универзален сет на бактерии за прајмери ​​генерира точни генски производи од 1,5 kb 16S rRNA користејќи ја извлечената метагеномска ДНК како образец. Лентата 1 е позитивна контрола на PCR. На лентата 2 и 3 се поставени примерокот третиран со 13 Ц-глукоза и контролата на 12-Ц-шеќер. jpg "target =" _blank "> Кликнете овде за поголем преглед.

    бактерии
    2. Дизајн на пиро-СИП експеримент со ултрацентрифугација на градиент густина на CsCl и дел со карактеризација на пиросеквенција на одделена ДНК. H = поголемо изобилство, L = помало изобилство и изобилство. Кликнете овде за поголем преглед .

    цревата
    3. Разновидност на бактерии и релативно изобилство во тешките фракции на природни ларви кои се хранат со гликоза (12 Ц-контролна ДНК) и 13 ларви нахранети со Ц-гликоза (13 Д-означени ДНК)./ Www.jove.com/files/ftp_upload/50734/50734fig3highres.jpg "target =" _blank "> Кликнете овде за поголем преглед.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    Колективно опишаниот овде протокол обезбедува едноставен, брз и ефикасен метод за одредување на метаболичките активности на цревната флора, кој понатаму би можел да се примени за да се процени специфичната улога на синдромите на Бакенријал во исхраната, детоксикацијата и одбраната на домаќинот.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.