Изолација и диференцијација на матични клетки добиени од масно потекло од свински поткожен маснотија

Вовед

Дебелината, што претставува приближно 30% од населението во САД, со индекс на телесна маса над 30, се појави како светски феномен 1. Дебелината 2-4 има тенденција да доведе до компликации поврзани со кардиоваскуларни болести, дијабетес тип 2 и рак. Затоа, дебелината може да се справи е важен приоритет. Дебелината се манифестира со масовно ширење на масното ткиво и се припишува на прејадување и седентарен начин на живот во современото општество. Така, одржувањето на транскрипциска регулација на дешифрирање на адипогенезата и липогенезата може да вети третман на дебелина или дијабетес.

3T3-L1, 3T3-F442A и други масни адипогени клетки на глувчето се применети за проучување на адипогенезата или липогенезата за време на развојот на масното ткиво. Сепак, постојат некои отстапувања во регулаторните механизми помеѓу клеточните линии in vitro и in vivo животно 6. Примарните матични клетки добиени од масно ткиво (ADSC) во фракцијата на васкуларните клетки на стромата можат да бидат изолирани директно од белото масно ткиво и да се предизвикаат да се разликуваат. Диференцијацијата на ADSC кај адипоцитите, најверојатно, рекапитулира процес на адипогенеза и липогенеза во развојот на масното ткиво in vivo 7.

Свињите се соодветен животински модел за проучување на адипогенезата и липогенезата во развојот на масното ткиво. Нашите претходни студии свињи 8-10 покажуваат дека изразувањето на стерол - регулаторниот елемент врзувачки фактор на транскрипција 1c (SREBP1c), важен фактор на транскрипција е познат да ја модулира синтазата на липогена масна киселина во транскрипцијата, која е инхибирана од полинезаситени масни киселини (PUFA) во свинскиот црн дроб и масното ткиво . Изразот на свињи SREBP1c намален за PUFA in vivo и in vitro е сличен на другите видови како што се човекот и глувчето 11-13. Овие ин витро студии за свињи се првенствено во диференцирани адипоцити добиени од свинско ADSC (pADSC). Затоа, оваа примарна клеточна култура pADSC може да се користи како сигурен клеточен систем за да служи како развој на масно ткиво или да проучува други апликации на матични клетки.

Протокол

ЗАБЕЛЕШКА: Овој метод е произведен и користен во истражување претходно пријавено 14-17 од оваа лабораторија; со текот на времето се менуваше методологијата. Тековната постапка е направена од прасе (старо од 7 до 9 дена) со сеење на 6-бунарни плочи со ткивна култура со просечно 60 гр свинско поткожно масно ткиво. Сите постапки беа спроведени на РТ освен ако не е поинаку наведено. Сите експерименти со животни беа одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни (IACUC) на Националниот универзитет во Тајван.

1. Подгответе медиум за варење

1. Добијте поткожна маст од вратот и грбот; 40 до 80 g на прасе (стари од 7 до 9 дена), во зависност од големината на свињите. Тука користете 60 гр поткожно масно ткиво добиено од свиња.
2. Подгответе медиум за варење: измерете го прашокот колагеназа II со вкупно 54.000 единици и растворете го во 90 ml Дулбеко модифициран медиум орел (DMEM, 60 g маснотии) во 100 ml серолошко шише (900 единици колагеназа/1,5 ml DMEM/g маснотии) ).
3. Нежно се вртеше за да се раствори стерилизацијата најмалку 15 минути и потоа се поминува дигестивниот медиум низ филтер од 0,22 μm за да се помине дигестивниот медиум на маса за тресење (100 вртежи во минута). Да се ​​чува на 4 ° C пред употреба.

2. Дисецирајте го поткожното масно ткиво од прасе

Слика 1. Прилагодена машина за сечење за на Изолација на користениот pADSC. Дисецирано масно ткиво од поткожно масно ткиво на свинско месо, составено од масен слој со прицврстени слоеви на кожа. Потребна е машина за сечење за да се намали масниот слој дебел околу 1мм, со избегнување на пресекување на слоевите на кожата. Лево надесно: држач за миење, подлога за режење, сечило за сечење јаглероден челик и завртки. Нож за режење вметнат помеѓу држачот за парчиња и подлогата за режење кога е составен. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

3. Собирање на pADSC од строма-васкуларниот дел

1. Поминете го дигестивниот медиум што го содржи вареното масно ткиво преку еден слој шифон во чиста стерилизирана колба Ерленмаер од 250 ml или серолошка колба од 250 ml. Користете клешти за да го притиснете центарот на шифонот за да го водите и поддржите преминот на варењето на храната.
2. Исцедете го и извртувајте го шифонот со клешти за да го завршите преминот.
3. Дистрибуирајте го дигестивниот медиум во четири 50 ml конусни центрифугални цевки (

4. Идентификација на обележувачи на површината на матични клетки од pADSC со проточна цитометрија

5. Диференцијација на pADSC во адипоцити, остеоцити и хондроцити

6. Боење на диференцирани адипоцити, остеоцити и хондроцити

Резултати од репрезентацијата

PADSC добиен од дорзално поткожно масно ткиво од свиња сееше на културните плочи или садови и се става во 2. Покажано е дека морфологијата на pADSC од васкуларната фракција на стромата е слична на глувчето или ADSC добиен од човекот. Дваесет и четири часа по сеидбата, под-конфлуент pADSC се придржуваше и имаше проширена морфологија слична на фибробласт (2А). PADSC ќе се спои во рок од 72 часа и е подготвен за адипоцити или друга диференцијација од мезенхимален тип (2 Б). pADSC покажува силен адипоген потенцијал по хемиска индукција и зрелите адипоцити може да се разликуваат по 9 дена со повеќе од 90% од pADSC кои покажуваат адипогена диференцијација (Слика 2C) да се гледа.

За решавање на својствата на pADSC откриени во овој протокол, површинските обележувачи на pADSC беа оценети со помош на анализа на проточна цитометрија. Како во 3 прикажани е , Површинските маркери за мезенхимални матични клетки, вклучувајќи CD29, CD44, CD90 и MHC I (или HLA I) беа многу изразени. Негативни маркери на површината како што се ЦД4а, ЦД31, ЦД45 и МХЦ II (или ХЛА II) тешко може да се забележат во pADSC добиени во протоколот (Слика 3). Овие резултати покажуваат дека овие pADSC прикажуваат својства на матични клетки од мезенхимален тип без значителна контаминација на матични клетки со ендотел или хематопоеза, вклучувајќи миелоидни или лимфни прогенитори.

За да се осигура дека pADSC претставува мезенхимални матични клетки, мултипотенцијата на pADSC е испитана со диференцијација во адипоцити, остеоцити и хондроцити. Овие адипоцити, остеоцити и хондроцити беа обоени со специфични бои, Oil Red O, Alizarin Red S и Toluidine Blue O, соодветно. (Слика 4). Овие податоци покажуваат дека овој протокол произведува pADSC, кои ја задржуваат му-топотенцијата со целосни својства што личат на претходници од мезенхимален тип.

Слика 2. Морфологија на pADSC од регионот на свинско месо. (А) Под-конфлуент pADSC заглавува и се шири по 24-часовно сеење на плоча со култура од 6 бунари. (Б) По 72 часа сеење, pADSC стана слив на плоча со култура од 6 бунари. (C) Зрели адипоцити се забележани по 9 дена од адипогената диференцијација од страна на pADSC. Сликите направени со зголемување од 100x беа микроскопија со фазен контраст. Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Слика 3. Идентификација на матични клеткиПовршински маркери за pADSC. 1 x 10 5 од pADSC беа имплементирани со специфични антитела и беа анализирани за маркери на матични клетки со анализа на цитометриска проток. Броевите го означуваат процентот на обоени клетки во популацијата (црвено) во споредба со небоената контрола. X-оската претставува релативен интензитет на флуоресценција. Оската y претставува популација на клетки. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Слика 4. Диференцијација на мултипотентен pADSC. Мултипотенцијата на pADSC беше утврдена со диференцирање на pADSC во (А) Одредени адипоцити, (Б) Остеоцити (C) Хондроцити и дамки од репрезентативни бои, Оил Ред О, Ализарин Ред С и Толуидин Блу О, соодветно. Сликите беа во (А) земени 100 x (Б) 200 х, и (C) Зголемен 100X со помош на микроскопија со фазен контраст. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Дискусија

Тука претставуваме сигурен клеточен систем за проучување на развојот на масното ткиво во примарната клеточна култура на pADSC. Во споредба со другите овековечени клеточни линии, овој метод обезбедува удобен начин да се изолираат големи количини на високо квалитетни возрасни мезенхимални матични клетки кои можат да се користат за проучување на процесите на диференцијација на адипоцитите или другите мезенхимални лози поврзани со развојот на животните in vivo. Критичниот чекор во овој модифициран протокол е дека можеме да добиеме PADSC со прасе од 7 до 9 дена бидејќи е лесно да се справуваме со малите прасиња во споредба со постарите свињи и слично на другите видови 19,20 Приносот и мултипотентноста pADSC се намалува кога свињите се на возраст од 21 година.

Потенцијални извори на матични клетки вклучуваат ембрионални матични клетки (ЕСЦ), индуцирани плурипотентни матични клетки (iPS) и постнатални возрасни матични клетки. Ограничувањето на ADSC, класифицирано како возрасни мултипотентни матични клетки, е дека мултипотенцијата на возрасни матични клетки во диференцијација на дивергентни лози е релативно ограничена во споредба со ESC или iPSC. Сепак, етичките прашања во врска со изведувањето на ESC и онкогените својства на iPS ја ограничуваат употребата на ESC и iPSC 22,23. Поради ова, бројни истражувачи се фокусирале на возрасни матични клетки со напори да ја подобрат плурипотенцијата. Најчеста причина за возрасни мезенхимални матични клетки (МСЦ) која долго време се изучува е мезенхимални матични клетки добиени од коскена срцевина 24. Сепак, бербата на коскената срцевина се смета за релативно болна постапка. Друг проблем е што приносот на матични клетки од коскената срцевина е конечен. Аспирира коскената срцевина просечно 6 × 10 6 нуклеарени клетки на ml, а MSC претставува само 0,001-0,01% од сите нуклеирани клетки. По разгледувањето на овие недостатоци, ADSC се предлага како помалку наметлив извор за да се добијат 25,26 мултипотентни матични клетки.

Признанија

Авторите им се заблагодаруваат на сите членови на лабораторијата за деталната дискусија и изразуваат поддршка на технологијата во овој протокол. Истражувањето спроведено во лабораторијата беше поддржано од грантови од Министерството за наука и технологија (МОСТ 103-2314-Б-002-126 и МОСТ 102-2313-Б-002-026-МИ3) и од грантови од Цел за врвниот универзитет -Планот поддржан (104R350144) Национален универзитет, Тајван.

---