Методи за проучување на врзувањето на лиганд

Методи за испитување на врските на лигандите Дијализа на рамнотежа, ензимска кинетика на модулот: раководител: проф. Ханс Бисвангер Надзор: Елена Кракер Протокол за тест: Пола Квек Стефан Мог Страна 1 од 15

врзувањето

Слика на насловната страница: Блок за дијализа Илустрацијата е шематска и не се однесува на производи што се на пазарот. Прикажаниот блок е поделен на две ќелии, секоја одделена со мембрана во внатрешна и надворешна комора. 1 Индекс 1.1 Содржина 1 Индекс. 2 1.1 Содржина. 2 1.2 Список на слики. 2 2 Вовед. 3 3 Материјал и методи. 3 3.1 Хемикалии и инструменти. 3 3.2 Тест со индол. 4 3.3 Дијализа на рамнотежа. 5 4 Експериментален дел. 7 4.1 Калибрација на тест со индол. 7 4.2 Одредување на времето на дијализа. 8 4.3 Изведување на рамнотежна дијализа. 10 5 Резиме и дискусија. 14 6 Литература. 15 1.2 Список на слики Слика 1: Боење на индол со реагенс на Ерлих. 4 Слика 2: Како работи рамнотежна дијализа. 5 Слика 3: Можни методи за проценка. 6 Слика 4: Калибрација на тестот со индол. 8 Слика 5: Одредување на времето на дијализа. 9 Слика 6: Дистрибуција на индол (истребување) по дијализа. 12 Слика 7: Дистрибуција на индол (концентрација) по дијализа. 12 Слика 8: Евалуација со помош на директна примена. 13 Слика 9: Евалуација со употреба на двојна реципрочна претстава. 13 Слика 10: Евалуација на Scatchard. 14 Страна 2 од 15

Пренос T = I/I 0 [] (1) Апсорпција A = 1-T [] (2) Истребување E = ε * c * d [] (3) E = log 1/T (4) ε: коефициент на истребување c: Концентрација г: Дебелина на слојот 3.3 Дијализа на рамнотежа Клетката за дијализа е поделена на надворешна и внатрешна комора со полупропустлива мембрана со дефинирана големина на порите: Слика 2: Како работи рамнотежна дијализа радиоактивно обележани според лиганд) во различни концентрации. Мембраната е пропустлива само за лиганд со мала молекуларна тежина (граница за исклучување клучни зборови), градиентот на концентрација се балансира со дифузија. Лиганд врзан за макромолекулата се повлекува од рамнотежата и се заменува со лиганди што течат додека слободните делови на лиганд во двете комори не се еднакви. Во рамнотежа, важи следново: [лиганд, надвор] = [лиганд, внатре, слободен] (5) [лиганд, внатре, вкупно] = [внатре, слободен] + [внатре, врзан] (6) 5 во 6 [Внатре, врзано] = [внатре, вкупно] [лиганд, надвор] (7) страница 5 од 15

4 Експериментален дел 4.1 Калибрација на тестот со индол За да може да се пресмета концентрацијата на индол од измерената апсорпција, направена е серија на разредување со познати количини на индол и тестот на индол се спроведува како што е опишано. Концентрациите во опсегот околу постојаната дисоцијација беа намерно избрани за серијата за разредување. Табела 1: Калибрација на индол тест Индол 1: 100 KPP (1000 μm) (0,1 M) V [μl] V [μl] c [μm] E [] *) (572 nm) 0 250 0 0,000 5 245 20 0,041 10 240 40 0,082 15 235 60 0,110 20 230 80 0,159 (Kd = 100 µm) 25 225 100 0,207 50 200 200 0,363 Концентрација во опсег 75 175 300 0,507 1/10 Kd