Од клиниката за акушерство

1 Од Клиниката за акушерство на Медицинскиот факултет на Универзитетот „Шарит универзитизедизин“ БИЛО БИРН ДИСЕРСТАЦИЈА Th 1 -цитокини и протромбиназа fgl2 во нормална и патолошка бременост Поднесени до Медицинскиот факултет во Харитетот на Универзитетот Хумболт со цел да се добие академска диплома доктор на лекар (д-р. Медицина) Берлин од Маике Кнакштет од Берлин

клиниката

2 декани: проф. медицински Ј.В. Дуденхаузен проф. Д-р. медицински Рецензент на Матин Пол: 1. Проф. медицински Ј.В. Дуденхаузен 2. Проф. медицински хабил H. Donat 3. Проф. Др. медицински Г. Шенфелдер Датум на докторат: 24 септември 2004 година

3 Содржина 3 Содржина Список на кратенки 5 Цели 6 1 Вовед Основи на имплантација на ембрион Почеток на бременоста Модел на трансплантација Патолошка имплантација Имунолошки основи на бременоста Парадигма Th 1/Th 2 Улога на Th 1 цитокините во бременоста Последици од имунолошка нерамнотежа во бременост Активирање на системот за коагулација Улогата на апоптозата во бременоста Аспекти на спонтаниот абортус Имунолошки принципи на спонтан абортус Два модели на абортус кај глувци CBA/J: стрес наспроти ИЛ имунолошки аспекти на прееклампсија Прашање 21 2 Материјал и методи Тест животни Колективен пациент Експериментална поставка на експерименти врз животни Стапка на абортус во проценти Подготовка на ткиво Вкупно извлекување на РНК ДНК третман на примероци од РНК Обратна транскрипција Квалитативна PCR-електрофореза на агароза Квантитативна PCR-анализа на податоците на Taq-Man Подготовка на плазмидна ДНК во мала размер (мини подготовка) линеаризација на плазмидната cDNA синтеза на 35 S-обележаната RNA сонда in situ хибридизација имунохистохемија ТУНЕЛ-обојување Гимеза боење статистичка анализа на податоците 41

4 Содржина 4 3 Резултати Зголемување на стапката на абортус преку стрес и преку вбризгување на IL-12 p Влијание на стресот врз изразувањето на мрната на абортогени цитокини Зголемувањето на TNF-α mna по изложеност на стрес Изразот на IFN-γ по примената на стресот Умре Влијание на изразот на мрна на IL-12 со стрес Односот на стапката на абортус до квантитативната количина на цитокини Профилот на цитокин по инјекцијата на ИЛ Споредбата на изразот на fgl2 мрна под стрес и по инјекцијата на ИЛ Индукција на апоптоза од стрес и ИЛ -12 во моделот на глувчето Изразот на TNF-α во првиот триместар и третиот триместар Изразот на fgl2 mrna и fgl2 протеинот во ткивото на плацентата на човекот Првиот триместар Трет триместар Апоптоза кај прееклампсија и спонтан абортус 59 4 Дискусија 61 5 Резиме 72 6 Список на публикации 74 7 Додаток 91

5 Список на кратенки 5 Список на кратенки// Зголемување/Намалување/константа АСА ацетилсалицилна киселина ЦД кластер на диференцијација ДНК Деоксирибонуклеинска киселина (А = Киселина) COX циклооксигеназа EGF епидермален фактор на раст Трансфераза ИДО Индоламин-2,3-диоксигеназа IFN-γ Интерферон-гама ИЛ Интерлеукин IRF Интерферон-регулатор-фактор LIF леукемија-инхибиторен-фактор LPS-липополисахариди MHC-главна-хистокомпатибилност-комплекс MHV3-хипепти-хипрома-вирус-хируп-хируп-вирус мрна (гласник) рибонуклеинска киселина (А = киселина) НК клетки/uNK клетки Природни клетки убијци/НК клетки на матката НЕ азотен оксид NOS (inos) азотен оксид синтаза (индуциран азотен оксид синтаза) OX орексин = CD 200 PAI инхибитор на плазминоген активатор PCR полимеразна верижна реакција PE прееклампсија PMNL полиморфонуклеарни леукоцити RT обратна транскриптаза TGF трансформирачки фактор на раст Th T помошна клетка Фактор на некроза на тумор во TNF-α-алфа VEGF васкуларен ендотелијален фактор на раст

6 Цел 6 Цел Целта на оваа теза е 1 во моделот на глувчето со комбинираната комбинација CBA/J-жени и DBA/2J-мажи, разликите во профилот на цитокин на матката и улогата на протромбиназа-фибриноген-протеин 2 (краток fgl2) во индуциран од стрес и абортус предизвикан од воспаление. 2 за да го карактеризираат профилот на цитокин во врска со можното активирање на системот за коагулација преку fgl2 како протромбиназа во резидуалното ткиво на пациенти со нормална бременост и на пациенти во првиот триместар со абортус. 3 за да се опише изразот на Th 1 цитокини и fgl2 во плацентарното ткиво од пациенти со некомплициран тек на бременоста и пациенти со прееклампсија во третиот триместар.

22 Вовед 22 Компликации во бременоста Се испитува спонтан абортус и прееклампсија и поврзаност со имунолошка нерамнотежа.

25 Материјал и методи 25 Ресорпција на имплантација Слика 3: Претставување на еден од страничните рогови на матката на глувчето во форма на буквата Две имплантации () и две ресорпции () се прикажани во матката на глувчето на ден 13,5 од бременоста, па затоа лежи во страничниот рог на матката прикажан погоре стапка на абортус од 50%. 2.5 Подготовка на ткиво За молекуларни биолошки истражувања, 100 мг од матката ткиво беа подготвени од места со успешна имплантација и внимателно измиени со стерилен PBS (pH = 7,4) и потоа веднаш замрзнат со употреба на течен азот и се чуваа на 80 C додека не се изолира РНК. Не беа земени примероци од ткиво од страната на апсорпција, бидејќи ткивото веќе се распаѓаше хеморагично и некротични и тест испитувањата покажаа дека ова ткиво е несоодветно за дијагностицирање на цитокин. 2.6 Вкупно извлекување на РНК Материјал: Тризол хлороформ етанол (100%, 75%) агарозен гел 1,5% етидуим бромид (10 мг/мл) Центрифуга за деспергеристетација (5415С) Гибко БРЛ, Карлсруе, Д Мерк, Дармштат, Д Мерк, Дармштад, Д Биозим, Олдендорф, Д Гибко БРЛ, Карлсруе, ДТ 8.10, Лабораториска технологија ИКА Епендорф, Хамбург, Д

31 Материјал и методи 31 (хипоксантин фосфорибозил трансфераза) добиен како референтен ген. Сондите беа проверени за нивната специфичност за ЦДНА, односно геномската ДНК не беше засилена. Секвенци на почетници: Murines HPRT: Ex 7,8: 5 -gttggatacaggccagactttgt Обратно: 5 -CACAggACTAgAACACCTgC Murines IFN-γ: Напред: 5 -CagCAACAACATAAgCgTCAT Обратно: 5 -CTCCTTTCCgctctCTgAggTctgggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTggTgTgg Murines fgl2: Напред: 5 -CAACAgTTTggATggCAAgTg Обратно: 5 -CTTTgTATATTAgATgAACCgg Murines IL-12 p40: Напред: 5 -TTCAgTgTCCTgCCAggAgg Назад: 5 -CgggTCTCCGGTTTG HPRT: 5-6FAM-TTgCAgATTCAACTTgCgCTCA XT CTT p PCR температура: 60 ​​C или 63 C мирови IFN-γ: 5-6FAM-TTCCggCAACAgCTggTggACCAC XT p PCR температура: 60 ​​C Мурени TNF-α: 5-6FAM-gTAgACAA Температура на PCR: 63 C Мурени fgl2: 5-6FAM-gTgTCCCAgCCAAgAACACA XT gca p PCR температура: 63 C

41 Материјал и методи Статистичка анализа на податоците За полу-квантитативна проценка на имунохистохемијата, користена е редна скала со оценките +/++/+++. За статистичката анализа на овие податоци, тестот Ман-Витни У беше користен како непараметарски тест за независни примероци. Податоците се прикажани графички во графикони. PCR во реално време беше оценет како што е опишано погоре. После приближниот тест за нормална дистрибуција, податоците беа оценети со Т-тестот на Студентот и презентирани во графикони со стандардна девијација.

47 Резултати 47 Исто така, IL-12 p40 (r = 0,24) и IL-12 p35 (r = -0,29) не покажуваат никаква врска со процентот на ресорпции (слика 11 и слика 12)% од абортусите r = IL-12 p40mrna Слика 11: Врска помеѓу процентот на абортуси и количината на IL-12 изразена p40 mrna Нема корелација помеѓу количината на IL-12 p40 и процентот на ресорпции% на абортуси r = IL-12 p35 mrna Слика 12: Врска помеѓу стапката на абортус во проценти и количината на изразена IL-12 p35 mrna Нема корелација помеѓу количината на IL-12 p35 и процентот на ресорпција.

48 Резултати Профилот на цитокин по инјектирање на IL-12 Прашањето е дали IL-12, како активен цитокин со Т-клетки, може да предизвика Th 1 имунолошки одговор во глувчето, што потоа доведува до зголемување на стапката на абортус. По инјекцијата на IL-12, мерењата покажаа 9,5 пати зголемување на IFN-γ mna (Слика 13). Интересно, инјектираниот, рекомбинантен IL-12, исто така, имаше влијание врз изразот на TNF-α: По инјекцијата, изразот на TNF-α mna се зголеми за 8,8 пати (Слика 13). После стимулацијата од IL-12, следува споредливо со cвездие на цитокини со истовремено присуство на високи количини на TNF-α и IFN-γ, како и со истовремено вбризгување на двата цитокина: 10 8 пати поголема од мрна n = 5 n = 7 n = 7 контрола, без инјекција IFN-γ mrna по IL-12 инјекција TNF-α mna по инјекција IL-12 Слика 13: Цитокинска регулација по инјектирање на IL-12 p70 Значително зголемување на TNF-α и IFN-γ по Инјекција на рекомбинантен IL-12 p Споредба на изразување на fgl2 мрна за време на стрес и по инјектирање на IL-12. Ин вирусната хибридизација ја прикажува хистолошката локализација на fgl2 мрната во матката на глувците CBA/J на ​​ден 13.5 од Бременост (слика 14).

50 Резултати 50 Беше откриено дека количината на TNF-α mna е негативно поврзана со количината на fgl2 mna (Слика 16). Нема статистички јасна врска помеѓу fgl2 mrna и IFN-γ mna (Слика 17). 9,5 9,0 TNF-α mna 8,5 8,0 7,5 7,0 r = Fgl2 mrna 6 8 Слика 16: Однос помеѓу количината на TNF-α и количината на fgl2 mna. Не покажува значајно Корелација помеѓу количината на TNF-α и количината на fgl2 mna, негативната врска помеѓу двата параметри може да се гледа како тенденција. 14 IFN- γ mna r = 0, Fgl2 mrna 6 8 Слика 17: Однос помеѓу количината на IFN-γ mna и изразената количина fgl2 mrna Нема корелација помеѓу количината на IFN-γ и количината на fgl2 mna.

53 Резултати 53 А Б Слика 20: Имунохистохемија за TNF-α во плацентата во 3 триместар со нормална бременост (А) ја покажува контролата на IgG и (Б) ја покажува бојата на протеинот TNF-α. Сад со Б трофобласт Слика 21: Имунохистохемија за TNF-α во плацентата во 3 триместар кај пациенти со прееклампсија (А) ја покажува контролата на IgG и (Б) ја покажува боењето на протеинот TNF-α. Табела 1 ја покажува специфичната анализа на позитивно-протеинските клетки на TNF-α кај прееклампсијата: Потекло на ткивото Ендотел Трофобласт Плацентарни макрофаги PE (n = 10) +/++ + +/++ Контрола (n = 12) + +/- +/++ Табела 1: Имунохистохемија за TNF-α во плацентата во 3 триместар кај нормална бременост и кај пациенти со прееклампсија Зголемена експресија на TNF-α протеин во ендотелни клетки и трофобласти во прееклампсија (ПЕ) во споредба со нормална бременост. Нема разлика во експресијата на TNF-α протеинот во клетките на трофобластите и плацентарните макрофаги.

54 Резултати Изразување на fgl2 mrna и fgl2 протеин во ткиво на плацентата на човекот Првиот триместар Слика 22 ги прикажува податоците добиени со помош на in situ хибридизација. A B Слика 22: Хибридизација in situ за fgl2 mrna вилус од 1 триместар (A) ја покажува контролата на сетилото и (B) ја покажува антисенс боењето за fgl2 mrna. Прикажани се плацентарните ресички со двоклеточниот трофобласт слој кој се состои од синциотирофобласти и цитотрофобласти кои се карактеристични за првиот триместар. Хибридизацијата in situ е извршена со употреба на сонда со 35 S означена fgl2 mna. Во обете прикажани ресички, има типично, црно обележување на трофобласт слој во антисенс примерокот, а примерокот мрна е огледална слика на низата fgl2 мрна. Во негативната контрола, примерокот за смисла, во кој примерокот е идентичен со низата fgl2-mrna, нема позитивен сигнал. Трофобластот исто така покажува позитивни сигнали (кафеав) за fgl2 протеинот во имунохистохемијата (Слика 21).

55 Резултати 55 А Б Слика 23: Имунохистохемија за fgl2 во плацентата во 1 триместар со нормална бременост (А) ја покажува контролата на IgG и (Б) ја покажува бојата на протеинот fgl2 и репрезентативниот дел на садот. Овие резултати за прв пат покажуваат дека fgl2 mrna и fgl2 протеинот се изразени во клетките на човечкиот трофобласт, особено ако се случил спонтан абортус. Бројот на fgl2-позитивни садови во вкупниот број пловни објекти беше зголемен доколку се случеше спонтан абортус (Слика 24). Fgl2 позитивни садови/вкупен број на садови 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 n = 6 * n =% медијана 25% контрола Спонтан абортус Слика 24: експресија на протеини fgl2 во ендотелијални клетки на Садови во првиот триместар Полу-квантитативна анализа на имунохистохемијата за fgl2 на садовите во decidua basalis за контрола и спонтан абортус.

56 Резултати 56 Полу-квантитативната проценка на изразот fgl2 на зотични трофобласти покажува дека пациентите со абортус имаат повисок израз на fgl2 отколку пациентите со изборен прекин на бременоста (Слика 25). Интензитет на боење на fgl2 позитивните зотични трофобласти 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 n = 6 * n = 9 75% медијана 25% контролен спонтан абортус Слика 25: експресија на протеини fgl2 кај трофобласти на првиот триместар Полу-квантитативна анализа на имунохистохемијата за fgl2 на клетките на трофобластите на decidua basalis при контрола и спонтан абортус ТБ-трофобласти на крвниот сад Слика 26: Имунохистохемија за fgl2 во плацентата во 1 триместар кај пациенти со абортус (А) покажува контрола на IgG и (Б) го покажува боењето на протеинот fgl2 и репрезентативниот дел на садот.

58 Резултати 58 Следната слика 28 покажува зрела плацентарна ресичка во третиот триместар со нормален тек на бременоста. Трофобластните клетки повремено изразуваат fgl2 протеин (Слика 26 Б). Слика 29 ја покажува плацентата на пациент со прееклампсија, со трофобластите кои изразуваат fgl2 протеин похомогено. Садови А Б Слика 28: Имунохистохемија за fgl2 во плацентата во 3 триместар со нормална бременост (А) ја покажува контролата на IgG и (Б) ја покажува бојата на протеинот fgl2. А Б Слика 29: Имунохистохемија за fgl2 во плацентата во 3 триместар кај пациенти со прееклампсија (А) ја покажува контролата на IgG и (Б) ја покажува бојата на протеинот fgl2. Во согласност со ова набудување, може да се забележат импресивни наслаги на фибрин кај примероците на плацентата кај пациентите со прееклампсија во споредба со примероците на плацентата во некомплицирана бременост.

59 Резултати Апоптозата кај прееклампсијата и спонтаниот абортус Th 1 цитокините, особено TNF-α, се способни да предизвикаат програмирана клеточна смрт во форма на апоптоза. Испитувањето на апоптотичните сигнали во првиот триместар и во третиот триместар покажа дека е забележана значително поголема инциденца на апоптоза и кај децидуата и кај плацентата на прееклампсија (Слика 30). А тунел + клетки на визуелно поле 2,5 * 2,0 1,5 н = 5 1,0 0,5 5 n = 6 Б тунел + клетки на видно поле * n = n =% медијана 25% 4 контрола на спонтан прееклампсија за контрола на абортусот Слика 30: Апоптоза во првиот и третиот триместар А: Полу-квантитативна анализа на апоптотичните сигнали при спонтан абортус. Б: Полу-квантитативна анализа на апоптотичните сигнали во прееклампсијата.

60 резултати 60 Слика 31 покажува апоптоза во плацентата во третиот триместар. Слика 31: Апоптоза во третиот триместар. Клеточните јадра се обоени во сина боја, а апоптотичните фрагменти флуоресираат зелена.