Одвојување на протеини за масена спектроскопија - LABO ONLINE
Одделни протеини за масена спектроскопија
Едноставна проценка се претвора во повеќе мерења
Дводимензионална капиларна електрофореза овозможува онлајн карактеризација на протеините одделени со електрофореза со гел со помош на масена спектрометрија. Овој метод е опишан од авторите во нивната статија за ЛАБО.
Гел-електрофореза за одделување на протеините според нивната големина е воведена пред 50 години [1] и се разви во најраспространета технологија за одвојување од ваков вид. Додадецил сулфат на натриум (СДС), кој формира комплекс со протеините, се додава во мешавината на протеини или протеини. Резултирачкиот негативен полнеж на СДС-протеинскиот комплекс го опфаќа внатрешниот полнеж на протеинот и е пропорционален на големината на протеинот. Како резултат, со слични стапки на полнење до маса, комплексите теоретски се одделуваат само врз основа на нивната големина во електричното поле со гел за раздвојување, обично гел од полиакриламид (PAGE). Со споредување на миграцијата на протеините што треба да се анализираат со миграцијата на протеините со познати маси, непознатата маса може да се процени со екстраполација. SDS-PAGE се користи за одредување на протеински маси и за одделување на комплексни протеински мешавини врз основа на нивната големина.
Поради релативно високата потрошувачка на лабораторија и време, оваа техника на анализа беше оптимизирана така што поделбата повеќе да не се одвива во кревет за одвојување, туку во кварцен стаклен капилар (СЕ (СДС)). Овој капилар има внатрешен дијаметар од претежно 50 μm и е исполнет со раздвојувачки гел пуфер. Ова се разликува од гелот за одвојување што обично се користи во SDS-PAGE во тоа што се користат линеарни растворливи во вода или се користат само малку вкрстено поврзани полимери (наместо полимери со вкрстено поврзување) за да може да се разменува тампонот за одвојување на гел во капиларот [2]. Раздвојувањето во капиларите може да се автоматизира и да се зголеми репродуктивноста. Друга важна предност на одвојувањето во капиларите е онлајн откривање со УВ-апсорпција или флуоресценција.Ова овозможува да се направат квантитативни изјави и да се одземат многу време фиксација и боење на одвоените протеини како со SDS-PAGE веќе не се потребни.
Теми во статијата
CE (SDS) е широко користен во биофармацевтската индустрија за тестирање и карактеризирање на чистотата и деградационите производи на терапевтските протеини како што се антителата. Фокусот на анализата е затоа одвојувањето и квантифицирањето на фрагментите што се јавуваат. Идентификувањето на овие фрагменти е уште една важна точка, бидејќи тие можат да влијаат на ефективноста на терапевтскиот протеин, а со тоа и на безбедноста на пациентот.
Неточна одредување на масата со екстраполација
Идентификацијата се покажа како огромен предизвик. Бидејќи ефикасноста на одделување на СЕ (СДС) честопати не е доволна, тоа може да доведе до криење на неколку фрагменти зад еден врв. Ова го отежнува доделувањето на врвовите на фрагментите со помош на експерименти со скокови (додавање на фрагменти кои се веќе идентификувани и набудување на зголемувања на површината на врвот). Идентификувањето преку проценетата протеинска маса со екстраполација исто така не е можно. Бидејќи, без оглед на тоа дали одвојувањето на протеините СДС се одвива во капиларите или во полимеризираниот гел, определувањето на масата е неточно. Покрај тоа, односот на врзан СДС со протеин може да се разликува, во зависност од редоследот и структурата на протеинот, што значи дека специфичната маса може да отстапи уште повеќе од реалната маса [3 - 4].
Непрецизната одредување на масата не дозволува јасна идентификација на нечистотиите. Со утврдување на точната маса на овие фрагменти со помош на масена спектрометрија (МС), сепак, идентификацијата е овозможена. За жал, директно спојување на СЕ (СДС) не е можно, бидејќи високо-вискозниот тампон за раздвојување на гел содржи декстран и непарливи компоненти како што се борат - но пред сè сурфактант СДС, што доведува до целосно потиснување на протеинот во процесот на јонизација [5]. Не е можно зголемување на скалата на овој метод на ЦЕ (СДС) за можна колекција на фракции со последователна подготовка на офлајн примерок во однос на компатибилноста со МС, заради малите волумени и многу вискозниот тампон за гел за одделување.
Интернет-масена спектрометрија преку дводимензионална капиларна електрофореза
Нашиот пристап за онлајн спојка на МС се заснова на префрлување на втора димензија на одвојување во форма на електрофореза на капиларна зона (CZE) помеѓу одделување на ЦЕ (СДС) и МС (Слика 1а) [6]. Ова овозможува да се одделат компонентите кои не се компатибилни со MS, од аналитот. Со цел да се реши многу стабилниот СДС-протеински комплекс неопходен за претходното раздвојување, неопходна е дополнителна обработка на примерокот. За оваа распаѓање на протеинскиот комплекс СДС, затоа беше развиена стратегија преку Интернет во втората димензија на одвојување. Ова се состои од ко-инјекција на органски растворувач (тука метанол) и катјонски сурфактант (овде цетилтриметиламониум бромид (CTAB)), кој е поставен пред или по протеинскиот комплекс СДС во капиларот од втората дистанцирана одвојувачка.
Спојувањето на генеричката поделба на СЕ (СДС) во првата димензија на одвојување со CZE во втората димензија на одвојување се одвива преку нанолитарски вентил со четири врски (VICI). Со овој вентил е можно да се примени висок напон (до приближно 15 kV), неопходен за раздвојување. Внатрешна јамка на примерок во опсег на нанолитар (4, 10 или 20 nl) овозможува овие многу мали количини да се пренесат од една во друга димензија.
Мерењето на фрагментите на недопрено, термички напнато антитело со дводимензионалниот систем на електрофореза на капиларите е прикажано на слика 2. Беше можно да се генерираат масени спектри од двата врва во димензијата СЕ (СДС). Стана очигледно дека не само еден, туку неколку фрагменти се кријат под секој врв на СЕ (СДС). За врв 1 (слика 2, сина), фрагментот 1C (23439,4 ± 1,5 Da) може да биде доделен на лесниот ланец на антителото. Фрагментот 1B со масовна разлика од 103,7 Da до лесниот ланец 1C може да се должи на C-терминално расцепување на цистеин и 1A на дополнителна елиминација на вода. За вториот врв на СЕ (СДС) (Слика 2, зелена) имало и три фрагменти од антитела. Масата на врвот 2C од 47638,2 ± 0,7 Da беше идентификувана како Fab фрагмент. Елиминацијата на последните две (T-H, =M = 238,2 Da) или три аминокиселини (K-T-H, ∆M = 366,2 Da) со елиминација на вода од овој Fab фрагмент резултира со врвови на масата 2B и 2A.
Заклучок и изгледи
Со дводимензионалниот метод на капиларна електрофореза претставен овде, можно е да се добијат онлајн масени спектри на претходно одделени протеини ЦЕ (СДС) без понатамошна подготовка на примерокот. Со точни димензии, можно е да се идентификуваат загадувачите во биофармацевтските производи и да се поддржи оптимизацијата на процесот за производство на соодветни лекови.
Литература:
[1] Laemmli Nature 1970, 227, 680-685.
[2] huу и сор. Анален чим акта. 2012, 709, 21-31.
[3] Гуан и др. Sci Rep 2015, 5, 13370.
[4] Рат и сор. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106 (6), 1760-1765.
[5] Рундлет и др. Анален хем 1996, 68 (19), 3493-3497.
[6] Ромер и сор. Анален биоанален хем 2019, 411 (27), 7197-7206.
АВТОРИ
Ennенифер Ромер 1
Кристина Монтеалегре 1
Бернд Мориц 2
Штефен Киесиg 2
Кристијан Нојсуќ 1
1 Универзитет во Ален, оддел за хемија
2 Ф. Хофман-Ла-Рош Рибар, Базел, Швајцарија