Примена на микрочестички маркери за проучување на дигестивната физиологија на Брахионус
Примена на микрочестички маркери за испитување на дигестивната физиологија на Brachionus plicatilis (Rotatoria) ИНВАГУРАЛНА ДИСЕРСТАЦИЈА за добивање на докторски степен на Математичкиот и природните науки факултет на Универзитетот во Келн претставена од Никол Анита Линдеман од Дуизбург Келн 2001 година
Известувач: проф. W. Kleinow Проф. Др. М. Дамбач Проф. Др. H. Arndt Ден на усното испитување: 11.05.2001 година
Содржина 3.2.4 Влијанија на факторите на милјето врз минувањето на храната 96 3.2.4.1 Микроскопско испитување на ph вредноста во желудникот и цревата на B. plicatilis 96 3.2.4.2 Влијание на вредноста на ph во медиумот 102 3.2.4.3 Споредба на стапките на навлегување и филтрација во пуфер медиум 105 3.2.5 Истражување на процесите на апсорпција во дигестивниот тракт на B. plicatilis 116 3.2.5.1 Апсорпција на хемоглобин 116 3.2.5.2 Директно откривање на апсорпција на протеини 121 3.3 Заклучни забелешки и општа дискусија 125 4. Резиме 130 5. Библиографија 132 Признанија Објаснување продолжи
Апстракт Содржината на дигестивниот тракт на B. plicatilis може брзо и лесно да се разменува со воведување на нов вид честички во медиумот. Клетките од квасец беа користени за замена на еритроцитите во дигестивниот тракт и за испитување на способноста на ротирачите да го контролираат внесувањето на честички на хранливи материи. Употребата на клетки од квасец обоени во бромотимол сино овозможува да се утврдат разликите во ph вредностите на желудникот и цревата. Понатаму, во експериментите за хранење овие клетки се корисни за да се испитаат разликите во лачењето на јони H + од цревата во културен медиум со различна моларност. Конечно, апсорптивните процеси може да се демонстрираат со замена на духовите еритроцити обележани со флуоресценција со неозначени духови и откривање на долготрајна преостаната флуоресценција во клетките на желудникот. 2
Материјал и методи 2. Материјал и методи 2.1 Често користени кратенки DTT FITC HEPES LSM MES RSA SDS TRA Tris rpm 1,4-Dithio-DL-Threit (ol) Fluorescein Isothiocyanate N-2-Hydroxyethylpierazine-N -2-етансулфонска киселина Ласерско скенирање -Микроскоп N-морфолин етанесулфонска киселина говеда серумски албумин натриум Додецил сулфат триетаноламин хидрохлорид трис (хидроксиметил) аминометан револуции во минута 5
Материјал и методи 2.2 Производител на хемикалии, супстанција Ниво на чистота Апли хем (Дармштат) Албумин од говеден серум Цитрат (лимонска киселина монохидрат) стр. а ДТТ МЕС квалитетен пуфер натриум хидроксид стр. а Хлороводородна киселина стр. а ТРА стр. а Боерингер (Манхајм) Трис кристален Мерк (Дармштат) бромотимол сино бромофенол сино глутаралдехид раствор 25% калиум хлорид стр. а Калиум хидроген фосфат стр. а Калиум хидроксид чист магнезиум сулфат 7-хидрат стр. а Натриум карбонат стр. а Натриум хлорид стр. а Натриум дихидроген фосфат 1 хидрат стр. а Натриум хидроген карбонат стр. а динатриум хидроген фосфат дихидрат стр. а Мешавина на морска сол на натриум дитионит Сера (Хајнсберг) 6
Материјал и методи Производител, супстанција Ниво на чистота Серва (Хајделберг) Хлорамфеникол Хепарин СДС Сахароза (сахароза) истражување одделение кристална Сигма (Минхен) FITC HEPES литиказа (од Arthrobacter luteus) Мертиолат (Тимеросал) Ридел-де-Хаен (Хановер) амониум хидроген амониум хидроген амониум хидроген амониум хидрогениум Хемикалиите кои не се наведени доаѓаат (во квалитет) од Мерк, Дармштад. Освен ако не е поинаку наведено, употребените раствори се мешаат со Аква стекнување. закажана. 7-ми
Материјал и методи 2.3 Специјални материјали Бренд (Wertheim/Main) Хепаринизирани капилари со микро хематокрит (должина: 75 ± 1,00 mm; внатрешен дијаметар: 1,15 ± 0,05 mm; надворешен дијаметар: 1,55 ± 0,05 mm), Комора за броење, Нојбауер (длабочина на комората: 0,1 мм; мрежа за броење: 9 големи квадрати секој 1 мм 2) стерилни ланци за крв BRAUN (Мелсунген), Solofix CORNING COSTAR GmbH (Боденхајм) Полиестерска мембрана Tanswell-Clear (дијаметар 24 мм, големина на пора 0,4 μm) PLANO (Wetzlar) Prep-Eze: корпа (тип А) со големина на мрежа од 75 µm цевка за дијализа ROTH (Карлсруе) направена од целулоза, Spectra/Por Membrane 3, MWCO: 3.500 работилница на филтер-апаратот за Зоолошки институт (Универзитет во Келн) (Lindemann & Kleinow), 2000), видете слика 1, која се состои од ПЕ цевка со цврсто запечатена маркичка и два излеза што може да се затворат. Печатот е покриен со Полимонска газа (PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Цирих, големина на мрежа 16 μm). Мал филтер-апарат, направен од стаклен шприц FORTUNA OPTIMA од 5 ml (Walter Graf and Co. GmbH & Co., Wertheim) со газа покриена (Polymon Gaze PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Цирих, големина на мрежата 16 µm) PE печат; Излезот на шприцот може да се затвори со стегач на црево. 8-ми
Материјал и методи 10 см Б А С Сл. 1: Апарат за филтрирање за концентрирање на ротифери или за отстранување на мали честички (еритроцити, алги или клетки од квасец) од средството што содржи ротифер. Цврсто запечатена маркичка покриена со Полимонска газа (големина на мрежа 16 μm) Б одвод за миење на средство за одвод C за концентрирани ротифери без честички 9
Материјал и методи 2.4 Методи на микроскопско набудување 2.4.1 Светлосен микроскоп Користено е следново: а) Пренесен светлосен микроскоп од лабораториски лак К (Лејц, Вецлар, зголемување помеѓу 40 и 1000). б) Микроскоп за пренасочување на пренесената светлина од Виловерт (Вил, Вецлар, зголемување помеѓу 40 и 320). 2.4.2 Флуоресцентен микроскоп Испитувањата на флуоресценцијата беа извршени на микроскоп на флуоресценција на Ортоплан (Leitz, Wetzlar, големини 63-400) со филтерот за возбуда L2 450-490 (сплитер 510, блокирачки филтер 525/20). Theивотните беа забележани на слајдовите на микроскопот под очилата за покривање. 2.4.3 Слики со микроскоп Сликите со светлосен микроскоп се направени со рефлексна камера Minolta X-300 со прицврстување на леќата Leitz Periplan (GF 12.5; TL 160 mm 10). Користени се следните филмови: Илфорд ПАН Ф Плус 50 АСА (црно-бел негативен филм), Кодак ЕКТАР 100 ИСО 100/21 (негативен филм во боја), Кодак ЕКТАР 1000-2 (негативен филм во боја), Кодак Ројал Голд 100 ИСО 100/21 (негативен филм во боја) ), Scotch CHROME 640-T ISO 640/29, 3200 k (филм со слајд во боја за светло на ламба со блескаво светло). Се користеше син филтер за да се компензира малата жолта нијанса предизвикана од вештачката светлина. 10
Материјал и методи 1 2 Сл. 2: Аранжман за набудување на одделни животни подолг временски период. Theивотните задржани на место со помош на стаклен капилар Пирекс () се наб observedудуваат во медиум за хранење преку превртен микроскоп. Стаклениот капилар се држи и го води микроманипулатор. Негативниот притисок во капиларот што се држи се проверува со помош на шприц од 2 ml (). 1 = микроманипулатор, 2 = слајд со додаток од 1 ml. 16
Материјали и методи 2.5.4 Имобилизирање на ротифери со натриум дитионит Со цел да се испитаат голем број ротифери микроскопски, животните беа имобилизирани со натриум дитионит. 500 μl медиум што содржи ротори биле инјектирани во реакционен сад Епендорф со 500 μl натриум дитионит (40 mg/ml). По третманот, ротиферите тонат на дното на садот во целосно проширена состојба. За да се одреди вкупниот број на животни и бројот на животни со исполнет (црвено-обоен) дигестивен тракт, во зависност од концентрацијата на ротирачите, од садот се пипетираа 20-100 μl на слајд со стакло во шупливо земјиште. 2.5.5 Производство на пуфер за растворање Производство на фон Клајнов и сор. (1991) развиен пуфер за растворање се случи на следниов начин: Во 2 ml дестилирана вода. Растворени се 0,18 МСД и 0,03 М амониум хидроген карбонат (pH 8). Пред почетокот на експериментот, 0,04 g ДТТ беа додадени во растворот. 17-ти
Материјал и методи 2.6.4 Духови на еритроцити 2.6.4.1 Подготовка на албумин FITC (Wißling, 1988 и sonонсон и Халбороу, 1986) Со цел да се спречи дифузирање на флуоресцентна боја од духовите, се врзува за протеините: 0,5 М повеќе алкални Тампон (рН 9,5) беше обезбеден со додавање на 5,8 мл 5,3 проценти раствор на Na 2 CO 3 на 10 мл 4,2 проценти раствор на NaHCO 3. 50 мг албумин се земени во 4,5 мл 0,9 проценти раствор на NaCl и се додадоа 0,5 мл алкален пуфер; по темелно мешање, се додадоа 1,5 мг FITC и растворот се мешаше на 22-25 ° C за 2 часа. Оваа мешавина дијализираше преку ноќ наспроти 4 l физиолошки солен раствор во лулка за дијализа. Готовиот флуоресцентно-протеински комплекс се чуваше на ладно и темно место. 2.6.4.2 Раствори Раствор за миење: хипозмотски пуфер: Тампон за миење: 0,9% раствор на NaCl 5 mm раствор MgSO 4 160 mm раствор KCl/5 mm раствор на HEPES, pH 7,4 Сите раствори се користени за подготовка на духовите приближно C ладен. 2.6.4.3 Производство на истоварени и натоварени духови Свежа хепаринизирана крв од цицачи (овци или говеда) беше центрифугирана на 5000 вртежи во минута на 4 ° C за 10 мин. По декантирање на супернатантот во плазмата и горниот леукоцитен слој што содржи слој на клетката, Седи- 20
Материјал и методи 2.6.4.4 Духови фиксирани со глутаралдехид Натоварените духови беа подготвени и фиксирани како што е опишано во деловите 2.6.3 и 2.6.4, а растворот на глутаралдехид се додава на подготвените и ладените духови без претходно миење . 22-ри
Материјал и методи Искористеност на филтерската корпа Ротифери еритроцити Слика 3: Шематски приказ на земање примероци: За фотометриски мерења, примерокот се пипетира од филтерска корпа што е достапна за еритроцитите, но не и за ротификаторите. Ова се постигна со лепење на 2-3 корпи за ткиво (големина на мрежа 75 µm, Plano GmbH Wetzlar). Во првиот час се земаше примерок на секои 5-10 мин., Во понатамошниот тек на тестот само на секои 20-30 мин. Кога беа земени примероците, 2 милилитри беа пипетирани од корпата за филтрирање во кивета. Со цел да се осигура дека суспензијата во филтер-влошката приближно одговараше на концентрацијата на еритроцитите или ослободениот хемоглобин во околниот медиум, содржината на филтрската корпа се пренесуваше неколку пати со помош на пипета во надворешниот медиум пред да се земе секој примерок. 24
Материјал и методи 2.7 Подготовка на клетки од квасец 2.7.1 Производство на суспензија на квасец 0,5 g пекарски квасец (Saccharomyces cerevisiae) се мешаат во 100 ml морска вода се додека квасецот не се распредели рамномерно. 2.7.2 Подготовка на фосфатниот пуфер според Sørensen 0,2 M фосфат пуфер pH 7,0 е подготвен со комбинирање на 30,5 ml раствор од 0,2 M Na 2 HPO 4 и 19,5 ml 0,2 M NaH 2 PO 4 - Направено решение. Добивме тампон 0,067 M Sørensen со разредување на 6,7 делови од тампон со 13 делови на дестилирана вода. (Досон и сор., 1969). 2.7.3 Подготовка на пуфер за калиум фосфат KH 2 PO 4 (0,05 М) се раствори во дестилирана вода. подготвени и прилагодени на pH 7 со KOH. 2.7.4 Боење на клетките на квасецот со индикаторна боја Наместо клетките на квасецот од „Preis Microplan“ користен од Клаус Киле (1983), се користеше свеж пекарски квасец за да може да се изостави првиот чекор на центрифугирање. Следниве чекори беа спроведени за да се обојат клетките на квасецот со индикаторна боја: Суспендирање на 250 мг свеж пекарски квасец во епрувета во 5,0 ml од 1/15 М фосфат пуфер (Sørensen) pH 7,0. - Додавање на 25 мг бромотимол сина (индикаторски опсег pH 6,0-7,8; промена на бојата од жолта (кисела) во сина (основна)) или бром - 26
a b c d Сл. 4а-г: Навлегување и пренесување на еритроцити во дигестивниот тракт на B. plicatilis. Типична секвенца по додавање на еритроцити во времето 0, забележана на ротифер што се држеше на отворот на стаклениот капилар Пирекс со вшмукување. При ова зголемување не беше можно да се фотографира целото животно во фокусот. Поради движењето на животните во средина, мораше да се изберат кратки времиња на изложеност со голема отвор. Лента за калибрација = 100 μm. а) По 10-20 секунди, видлива е мала црвена боја на желудникот. б) По 180 секунди стомакот е јасно исполнет и може да се забележи првата боја на цревата. в) По 15 минути желудникот и цревата се обоени интензивно црвени. г) По 17 минути, содржината на цревата се исфрла преку анусот. Процесите на поминување по првиот процес обично беа забрзани, така што следната евакуација на дебелото црево се случи по само 10 минути. Кај сите употребени еритроцити кај цицачите (луѓе, говеда и овци), во фецесот можеше да се забележат само фрагменти од мембраната и облак од црвена боја, кој се состои од ослободен хемоглобин, кој брзо се распрснуваше во медиумот. Во поединечни случаи кои сè уште се видливи при првото движење на дебелото црево, 30
Доколку ваквите проблеми можат да се решат, употребата на духови што биле исполнети со флуорогени ензимски подлоги би можела да се замисли за понатамошни истражувања. Овој метод може да се искористи за на пр. Локализирајте ги ензимите во дигестивниот тракт. а б Сл. 5а-б: Брајтфилд и флуоресцентна фотографија на ротифер 5 мин по хранење со духови кои беа исполнети со албумин обележан со FITC (лента за калибрација = 50 μm). 50 μl суспензија со духови на FITC албумин беа додадени на 500 μl медиум кој содржи ротифери. По пет минути навлегување на честички, ротирачите се ослободија од слободните духови на флуоресценција, исплакнувајќи ги неколку пати преку најлонски филтер од 16 μm, а примерок од животинско потекло беше пренесен на слајд со покривно стакло. а) Флуоресцентна слика, б) За да се локализира флуоресценцијата во дигестивниот тракт, сликата а беше превртена и поставена над сликата на светло поле на истото животно. 33