Влијание на седиментација на цинк и липиди врз 3, 2-еноил-CoA изомераза и избрани карактеристики
1 Влијание на седиментација на цинк и липиди врз 3, 2-еноил-CoA изомеразата и избрани карактеристики на метаболизмот на липидите кај стаорци што растат Jенифер Јустус Воведна дисертација за добивање на докторат (д-р Оец. Троф.) На Факултетот за земјоделски науки, Екотрофологија и управување со животната средина на Јустус Либиг универзитет Гисен
3 Од Институтот за исхрана на животните и физиологијата на исхраната на Универзитетот usастус Либиг во Гисен Влијание на седиментација на цинк и липиди врз изомераза Δ 3, Δ 2 -еноил-CoA и избрани карактеристики на метаболизмот на липидите кај стаорци во пораст Воведна дисертација за добивање на докторски степен (д-р Оец . трофеј.) на Факултетот 09 - Земјоделски науки, екотрофологија и управување со животната средина на Универзитетот usастус Либиг во Гисен поднесено од Дипл. ОЕЦ. трофеј. Ennенифер Јустус Гисен 2007 година
4 Дисертација на Факултетот за земјоделски науки, нутриционистички науки и управување со животната средина на Универзитетот usастус Либиг од Гисен Дин: Проф. R. Herrmann Испитен комитет: Претседавач: Проф. Др. I. Хофман 1-ви рецензент: проф. Д-р. Е. Вајганд 2-ри рецензент: проф. J. Палауф Испитувач: Проф. Др. Х. Брикнер Испитувач: ПД Др. Денот на дискусијата на С. Рудлоф: 22 јануари 2007 година
5 Содржина I Содржина Список на слики. IV список на прегледи. V Список на анекс табели и бројки. VII Список на кратенки. IX 1 Вовед Дефицит на цинк и негово влијание врз метаболизмот на липидите Елемент во трага цинк Дефицит на цинк Биолошки функции на метаболизам на цинк и одредување на статус на цинк Регулирање на експресија на гени со цинк Промени во метаболизмот на липидите и специфичен метаболизам на незаситени масни киселини Промени во метаболизмот на липидите во недостаток на цинк Деградација на незаситени масни киселини и функција на Δ 3, Δ 2 -Еноил- CoA изомераза Изразување модулациски потенцијал на незаситени масни киселини Експериментален дел Истражувачко прашање Опис на експериментот Состав на експериментални диети Добивање и обработка на анализата материјал Аналитички методи Хемоглобин, хематокрит Содржина на маснотии во изметот Одредување на цинк статус Концентрации на протеини Активност на Д 3, Δ 2 -Еноаз-субстрати на енозит е Обнова на митохондријалните фракции Δ 3, Δ 2 -еноил-CoA изомераза анализа анализа на експресија на генот на анализа на сукцинат дехидрогеназа анализа на вкупна РНК. 37
6 II Содржина RT-PCR електрофореза со агарозен гел и проценка на оптичките густини Липиден профил Плазма липиди Липиден профил на црниот дроб Модел на масни киселини на липидните фракции на црниот дроб Кетонски тела во плазмата и урината Статистичка проценка на резултатите од експериментот Внес на храна, развој на жива маса, конверзија на храна и сварливост на маснотии Статус на цинк и хематолошки параметри Активност на Δ 3, 2 -еноил-CoA изомераза mrna-експресија на изомеразата Δ 3, Δ 2 -еноил-CoA и PPARs алфа и гама плазма липидни липидни фракции на црниот дроб масна киселина шема на црните дробови липидни фракции кетонски тела Дискусија Коментар за животинскиот модел Влијание на снабдувањето со алиментарен липид и цинк Статус на раст и цинк на испитаните животни Влијание на седиментација на цинк и липиди врз активноста и изразување на изомераза Δ 3, Δ 2 -еноил-CoA Влијание на изразување на PPARalpha, PPARgamma и концентрацијата на кетонското тело Ефекти врз липидниот профил на плазмата и црниот дроб Влијание на цинкот - и седиментација на липиди врз моделот на масни киселини на вкупните липиди, триглицериди и фосфолипиди на црниот дроб Заклучок Резиме библиографија Додаток. 106
7 Содржина III Резиме Апстрактно објаснување. 136
10 VI Преглед на содржина Преглед 23: Преглед 24: Преглед 25: Преглед 26: Преглед 27: Релативна содржина на целосен липид, холестерол, триглицерид и фосфолипид во црниот дроб (mg/100 g жива тежина). 59 масни киселини на вкупните липиди на црниот дроб (g/100g вкупни масни киселини). 61 масни киселини на вкупни липиди на црниот дроб (mg/g FM црн дроб). 64 масни киселини на фракцијата на црниот дроб триглицерид (g/100g вкупни масни киселини). 66 масни киселини на хепаталната фосфолипидна фракција (g/100g вкупни масни киселини). 67
12 VIII Содржина Табела А 23: Табела А 24: 3-хидроксибутират концентрации во плазмата и урината за време на периодот на собирање FS метил естер во мешавината FAME C4-C24 (18919, Сигма) Табела А 25: Податоци за LCQ Слика А 1: Молекуларна структура и молекуларна тежина на транс-3-хексеноил-коа Слика А 2: Масени спектри на прочистениот транс-3-хексеноил-коа, позитивен режим погоре, негативен режим подолу Слика А 3: Протокол на автомобилски комплет 3-HB (Wako Chemicals). 132
13 Содржини IX Список на кратенки 3-HB 3-хидроксибутират АИ Адекватно внесување на АЛА алфа-линоленска киселина АП Алкална фосфатаза БХТ Бутилхидроксилтолуен БСА серумски албумин од холин во холестерол CoA коензим А ЦРИП цистеин богат со протеини преку црево ДЦИП 2,6 1 (исто така Nramp2) ДЕПЦ диетилпирокарбонат ДХА Докосахексаеноична киселина ДРИ Диетална референтна доза DTNB 5,5 -Дитиобис (2-нитробензоева киселина) ECI Δ 3, Δ 2 -Еноил-Коа-изомераза ЕПА Еикозапентаеноична киселина раствор на киселинска киселина кисела киселина кисела киселина кисела киселина фаети -3-фосфат дехидрогеназа GC гасна хроматографија GFS заситени масни киселини (диета со путер од какао) GL вкупни липиди Hb хемоглобин Hk хематокрит HNF-4 хепатален нуклеарен фактор-4 hzip4 човечки zrt-, irt-протеин 4 hztl1 човечки ZnT-транспортер 1 ICP-AES Индуктивно споен плазма Спектрометар за атомска емисија е внатрешен стандард LM растворувач М просек
14 X Содржина MFE1 Мултифункционален ензим 1 мин минута MRE Елемент на метален одговор MT Metallothionein MTF1 MRE-врзувачки Фактор на транскрипција-1 MUFS полинезаситена масна киселина н.н. не се забележува, количината под границата на откривање не е значајна p Веројатност за грешка PC phosphatidylcholine PCR полимеразна верижна реакција PL рецептор за размножување на фосфолипид ПП-пероксизом PPAR-пероксизом-активирачки рецептор-рецептор PPRE PPAR-елемент на одговор RDA Препорачана додаток на исхраната RT Обратна транскриптаза RXR SDHepthy Standard Standard Deviation SREBP-1 Стерол Регулаторни елементи за врзување на протеини-1 Т а TAE TG T m TM TMSH Температура на загревање Трис-ацетат-ЕДТА-тампон Триглицерид Температура на топење Сува материја Н-триметилсулфониум хидроксид U Ензимска активност (единица, обрт на подлогата во микролиуми -1) UFS Масни киселини (диета со масло од шафон) UL Толерантно горно ниво на внес v волумен, видете споредба наспроти w тежина Zn цинк ZnT-1 транспортер на цинк-1
19 Преглед на литературата 5 врзани лиганди: на три аминокиселини (His, Glu, Asp или Cys) и молекула на вода. Цинк е фиксиран од три негови во јаглеродна анхидраза и од неговиот-Глу-Хис во карбоксипептидаза (VALLEE and AULD 1990, MCCALL et al. 2000); отсуството на цинк доведува до губење на каталитичката активност. Како структурна компонента, цинкот е тетраедрално врзан за четири аминокиселини (Cys или His) и влијае на локалната конформација и стабилност на ензимот (Слика 1 А). AB Слика 1: Цинк структури (А) во металоензими на цинк, (Б) во ДНК-врзувачки домени на фактори на транскрипција (според VALLEE и AULD 1992) Цинкот ја одредува и тродимензионалната структура на прстите на цинкот, кластерот на цинк и цинк на ротација, група на фактори на транскрипција што содржат цинк ( Слика 1 Б). Протеините на прстите на цинк се едни од најчестите протеини во еукариотскиот геном, кои, поради нивната тродимензионална конформација, можат да комуницираат директно со ДНК. Некои од нивните различни функции во регулативата за транскрипција сè уште се разјаснуваат (LAITY et al. 2001). Cys 2 His 2 и Cys 3 Неговите цинкови прсти исто така можат да препознаат специфични РНК низи преку различни механизми и да се врзат за нив (ХАЛ 2005).
24 10 Преглед на литературата 2.2 Регулирање на генската експресија преку цинк И каталитичката и структурната, како и регулаторната функција на цинкот се поврзани со влијанието врз изразот на генот (прегледано од VALLEE и FALCHUK 1993, КОУСИНИ 1998, ДРЕОСТИ 2001). Како суштински чекор во транскрипцијата, синтезата на РНК се одвива преку каталитичката активност на РНК полимеразите, за кои, како металоензими, се потребни два атома на цинк. Важноста на структурната функција на цинкот најимпресивно се открива со мотивите на цинковиот прст: Структурата на прстот во облик на јамка се создава кога атомот на цинк е тетраедрално комплексиран со остатоци од цистенил или хистидил од пептидниот ланец (Слика 1 Б). Тоа е предуслов за интеракција со ДНК. Според новите пресметки, 10% од хуманиот протеом се потенцијално врзувачки со цинк протеини (ANDREINI et al. 2006), од кои најбројни се прстите на цинкот, од кои повеќето функционираат како фактори на транскрипција. Физиолошка модулација од одговор на цинк, директна регулација на секундарните медијатори, регулирана транскрипција регулирана транскрипција протеини на мрнас Слика 3: Можни нивоа на влијание на цинк врз генската експресија (по КОУСИНИ 1998)
58 44 Експериментален дел, Преглед 14: GC параметри и температурни програми за одредување на FS-шема Откривање: FID горивни гасови: H 2 (35 ccm/min) синтетички воздух (250 ccm/min) шминка гас N 2 (25 cc/min) Авто-примерок: Chrompack Тип 910 Инјектирање: Сплит Волумен: 1 μl Влез: Стакло Glassвонче Носен гас: H 2 вкупни екстракти од липиди: Разлик на проток: 25 cc/min Пред-притисок на носачот на гас: 80 kpa Температурна програма: 200 C, 2 C/min до 220 C 220 C 45 мин елиат на триглицерид: проток на сплит: 20 см/мин притисок на прием на гас-носач: програма за температура од 60 kpa: 220 C 23 min 2 C/min на 230 C 230 C 35 min елуат на фосфолипид: сплит проток: 15 cc/min притисок на внес на гас на носач: 55 kpa Температурна програма: 220 C 20 мин. 4 Ц/мин до 235 Ц 235 Ц 25 мин
59 Експериментален дел 45 Стапката на обновување на стандардот FAME редовно се проверуваше (по 2 до 3 примероци) и беа користени најмалку три GC текови по примерок за евалуација. Врвовите што не може да се доделат на ниту еден ФС не беа вклучени во анализата. Границата на квантификација беше 0,05% до 0,2% (w/w) од вкупните масни киселини, во зависност од индивидуалната ФА и содржината на липидите во екстрактот. Хроматограм на стандардот FAME е прикажан на слика 7. Комплетните имиња на СИМЕ содржани се дадени во додатокот. Слика 7: GC хроматограм на кетонските тела FAME-Mix C4-C во плазмата и урината Концентрацијата на 3-хидроксибутират (3-HB) во плазмата и урината е утврдена со употреба на 3-HB автокит (Wako Chemicals). Протоколот за утврдување е даден во додатокот. Користени се 8 µl плазма или 20 μl урина и за утврдување на празна вредност аква стекнување. Стандардот 3-HB (Кетонски калибратор за тело) беше разреден според волуменот на примерокот. Концентрациите на 3-HB во плазмата и урината се утврдени во дупликат кај пет животни по група.