Човечки 3D вонклеточен матрикс-адипоцитен модел на култура за проучување на метаболички матрикс-клетки

Резиме

Ние опишуваме 3Д систем на екстрацелеточна матрица адипоцити in vitro култура што овозможува разградување на улогите на матрицата и адипоцитите при кодирање на метаболичкиот фенотип на масното ткиво.

Апстракт

Вовед

Вонклеточната матрица (ECM) не само што обезбедува механичка рамка за ткивото, туку исто така интервенира во комплексен разговор со клетки кои престојуваат во него и регулира различни процеси потребни за ткивна хомеостаза, вклучувајќи клеточна пролиферација, диференцијација Сигнализација и метаболизам 1. Додека здравиот ECM игра суштинска улога во одржувањето на нормалната функција на ткивото, дисфункционалниот ECM е вмешан во неколку болести 2 .

Масното ткиво игра важна улога во патогенезата на метаболичките болести. Дебелината е поврзана со прекумерна хипертрофија на масните клетки и клеточна хипоксија, дефекти во метаболизмот на масните клетки и масното ткиво, повеќе ендоплазматски мрежи и оксидативен стрес и воспаление. Иако слабо разбрани, овие сложени процеси прават заговор за компромис на капацитетот на пуфер во масното ткиво, што резултира со прелевање на хранливи материи од масното ткиво, токсичност на повеќе ткива и системско метаболичко заболување 3, 4, 5. Редоследот на настаните и специфичните механизми кои лежат во основата на слабоста на масното ткиво се слабо разбрани, но се вклучени промени во ECM на масното ткиво. Составот на ECM се менува во масното ткиво кај дебелината кај луѓето и глувците, со зголемено таложење на ECM протеини заедно со квалитативни биохемиски и структурни разлики во ECM на масното ткиво поврзани со метаболички болести кај луѓето, вклучувајќи дијабетес тип 2 и хиперлипидемија 6,7, 8, 9, 10, 11 .

И покрај овие согледувања, улогата на ECM на масното ткиво во посредувањето на дисфункцијата на масното ткиво не е добро дефинирана. Ова делумно се должи на недостаток на робусни експериментални модели кои овозможуваат распаѓање на специфичните улоги на ECM и масните клетки во регулирањето на крајната масна функција. Културата на маснотии ECM ја симулира животната средина in vivo на мајчиното масно ткиво во најмалку две точки. Прво, културата ECM обезбедува молекуларна средина што личи на природно масно ткиво, вклучувајќи природни колагени, еластини и други протеини на матрицата кои недостасуваат во стандардна 2D култура. Второ, се покажа дека културата на 2D пластика го менува метаболизмот на маснотиите преку механички ефекти како резултат на намалена еластичност на пластичната подлога 12, што ја елиминира културата на ECM.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Дебелите ткива се набавуваат од човечки субјекти кои се подложени на изборна баријатриска хирургија под одобрение на одбор за институции.

1. Изолација на паредипоцитите и подготовка на реагенси за култура

  1. Подгответе 2% говезен серумски албумин (BSA) во 1x фосфат, солен раствор (PBS). Стерилизирајте го филтерот и чувајте го на 4 ° C.
  2. Подгответе тип II колагенски нос: 2 mg/ml во 2% BSA во 1x PBS. Подгответе се веднаш пред употреба.
  3. Подгответе раствор за ладење на црвените крвни клетки (RBC): 1,5 M NH4Cl, 100 mM NaHCO3, 10 mM динатриум ЕДТА во дејонизирана вода (DI/H2O). Да се ​​чува на 4 ° С. Подгответе раствор на лажење 1BC RBC од 10x раствор за складирање во DI/H2O непосредно пред употреба.
  4. Подгответе медиум за раст: 15% серум од фетална говеда (FBS), 1% антифунгален раствор (ABAM) во модифициран орел медиум на Дулбеко: смеса за хранливи материи F-12 (DMEM/F12). Стерилизирајте го филтерот и чувајте го на 4 ° C.
  5. Подгответе раствор за замрзнување на предидоцитите: 10% диметил сулфоксид, 15% FBS во медиум DMEM/F12. Стерилизирајте го филтерот и чувајте го на 4 ° C.
  6. Подготовка на диференцијациски медиум: 10 mg/L трансферин, 33 'M биотин, 0,5' M раствор на хуман инсулин, 17 'M Д-пантотенска киселина хемикалциум сол, 100 nM дексаметазон, 2 nM 3,3', 5-тријодо-L-тиронин натриум сол (T3), 1 изобутил-1-метилксантин (IBMX), 1% ABAM во DMEM/F12. Стерилизирајте го филтерот и чувајте го на 4 ° C.

3. Подготовка на реагенси во метаболички фенотипизација

  1. Внес на гликоза
    1. Подгответе медиум за гладување во серум: DMEM/F12, 1% ABAM. Стерилизирајте го филтерот и чувајте го на 4 ° C
    2. Подгответе 200 nM раствор на хуман инсулин во 1x PBS непосредно пред употреба.
    3. Подгответе 200 nM човечки инсулин, 0,1 mM 2-деокси-D-глукоза, 1 Ci/бунар деокси-D-глукоза, 2- [1,2-3 H (N)] -, во 1x PBS. Подгответе се веднаш пред употреба.
  2. Липолиза
    1. Подгответе изопротеренол разреден во PBS: 3 мм раствор на резерви. За анализата, разредете работна концентрација од 3 m.
  3. Боење на маслото црвено-О
    1. Подгответе 4% формалин во DI/H2O. На собна температура.
    2. Подгответе работен раствор за масло Red-O. Разредете раствор на црвено-о масло (ORO) со DI/H2O во сооднос 3: 2 (ORO: DI/H2O). Подгответе се веднаш пред употреба. Филтрирајте низ филтер-хартија (Табела со материјали).

4. Набавка на масно ткиво

ЗАБЕЛЕШКА: Висцералното масно ткиво (ДДВ) е отстрането од хирургот од поголемиот оментум на почетокот на операцијата и се транспортира назад во лабораторијата на мраз за непосредна обработка. Треба да се следат универзални мерки на претпазливост при ракување со сите човечки ткива и корозивни реагенси, вклучително и извршување на целата работа во ламинарна хауба со проток, со користење на целосна лабораториска безбедност и абење, и без релапс на игли.

  1. Додадете 5-10 g непроменет данок на продажба на 15-25 ml раствор на замрзнување пуфер во конусна цевка од 50 ml за да го потопите примерокот од ткиво. Чувајте ги примероците на -80 ° C до децеларизација до 1 месец.
  2. Користете посебен свеж примерок за ДДВ за изолација на предедицити, како што е опишано во Дел 5.

6. Подготовка на ECM на масното ткиво

8. Метаболен фенотип

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

човечки
Слика 1: Тек на работа за подготовка на ECM-адипоцити. Ден 1: Цели примероци на висцерално масно ткиво минуваат низ три циклуси на замрзнување-одмрзнување, проследени со инкубација преку ноќ со ензимски дигестивен раствор # 1. Ден 2: По варењето на храната со ензимски раствор # 1, примероците се варат со ензимски раствор за варење бр. 2 преку ноќ. Во овој момент, примероците се делумно делипидирани. Ден 3: По ензимско варење бр. 2, примероците се инкубираат преку ноќ со раствор за екстракција на поларен растворувач кој ја комплетира делипидацијата. После 3-тиот ден, примероците треба да бидат целосно разочарани и да бидат во бела/проucирна боја. Примероците се мијат темелно со пуфер раствор за плакнење, потоа 70% етанол и се чуваат во раствор за складирање на 40 ° C сè додека не можат да се надополнат со пресипоцити. Ден 4: Preadipocytes се засадени во декеларизиран ДДВ за 14 дена, проследено со адипогена диференцијација. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

матрикс-адипоцитен
Слика 2: Работно изолирање на предедипоцитите. Данокот на продажба се сецка, се вари со колагеназа, се филтрира, центрифугира, а добиениот стромоваскуларен клеточен пелет е позлатен и култивиран за проширување на пресипоцитите. За повеќе информации во врска со изолацијата на човечките пресипоцити и културата на 2Д адипоцити, видете Бејкер и сор. 2017 година 21. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

матрикс-адипоцитен
Слика 3: Скенирање на слики со електронска микроскопија. Неоштетено масно ткиво, децеларизирано масно ткиво и децелуларизирано масно ткиво кое беше повторно населено со препоцити за 14 дена и диференцирано во адипогени медиуми. Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа слика.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Објавени се слични методи за изолација на ECM од масното ткиво и сеидба со пресипоцити, со докази кои сугерираат дека ECM може да промовира адипогена диференцијација без класични адипогени медијатори, вклучително и агонисти на cAMP. Инсулин и ППАР агонисти 12, 14. Нашите податоци се првите што демонстрираат специфично регулирање на болеста на клеточниот метаболизам преку ECM во масното ткиво, користејќи методи во кои адипоцитите се стимулираат со класични адипогени фактори на диференцијација 11; Слични студии без адипогени стимули се цел на идните истражувања. Другите имаат слично прелевање на СЦМ-клетки специфични за болести со ECM и клетки од белодробно ткиво 19, 20. Користени се и алтернативни стратегии, вклучително и создавање на матрици со мешање на препарати на хомогенизирани масни ткива ECM во пептидни хидрогели 12 .

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Откривање

Авторите не изјавуваат никакви спротивставени интереси.