Човечки модел Ex Vivo атеросклеротична плакета за проучување на протокол за биологија на лезии (превод на германски)

Резиме

Атеросклерозата е хроничен воспалителен процес. Овој ракопис илустрира лесен за употреба модел ex vivo за испитување на свежи каротидни или коронарни срцеви плаки. Ex vivo моделот овозможува испитување на можни супстанции врз воспалителното опкружување кај човечки артериосклеротични лезии и резултатите може да се испитаат со различни методи.

vivo

Апстракт

Вовед

Атеросклерозата како хронично воспалително заболување е една од најголемите причини за смрт во индустриските развиени земји 1/2. Компликациите на атеросклерозата, особено акутниот коронарен синдром, се поврзани со руптура на ранливите лезии, што доведува до атеротромбоза и васкуларна оклузија 3. Вродениот и стекнат имунитет се чини дека е вклучен во сите чекори на атерогенезата од 2,4-5. Иако е направен значителен напредок во третманот на срцев удар, ефективната превенција од атеросклероза и кардиоваскуларните несакани ефекти сè уште не се решени. Така, проучувањето на лезиската биологија е важно за зголемување на нашето знаење за патофизиологијата на атеросклерозата и за овозможување идентификување на нови терапевтски цели и развој на нови терапии.

Во многу случаи, модели на глувци се користат за проучување на патофизиологијата на специфични болести. Сепак, проучувањето на атерогенезата со употреба на модели на глувци е акципирано од неколку ограничувања: (1) Типично, на атеросклеротичните глувци им се дава диета со висок холестерол. Нивото на холестерол кај овие модели не може да се спореди со оние кај пациенти со покачени нивоа на холестерол во серумот 6. (2) Постојат значителни разлики помеѓу глувчето и човечкиот имунолошки систем; со тоа, Foxp3 е специфичен маркер за Т-клетките на регулаторот на глувчето, додека изразот на човечки Foxp3 во човечките Т-клетки не мора да дава регулаторен фенотип 7. Исто така, парадигмата Th1/Th2 како кај луѓето не е дефинирана за Т-клетките на глувчето. Целосно преносливи клетки. (3) Збир на маркери кои се користат за идентификување на моноцити и макрофаги во глувци, како што се F4/80 и маркери на класични (М1) наспроти алтернативни модели на активирање кои не се присутни во човечките миелоидни клетки 8. (4) Пронајдено е дека есенцијалното изразување на глувците и човечките моноцити во периферната крв 9.

Така, со цел да го зголемиме нашето разбирање за хроничните воспалителни процеси кај атеросклерозата кај луѓето, треба да искористиме модели за работа со човечко ткиво, крв или клетки. Овде опишуваме модел на култура на ткиво на човечки плаки што овозможува истражување на можни нови супстанции во концептот на човечка воспалителна лезиолошка биологија.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

1. Подгответе медиум како што следува

  1. Културен медиум: медиум RPMI.
  2. Станете 10% серум на фетално теле (FCS).
  3. Со 100 U/ml пеницилин G и 100 g/ml стрептомицин.

2. Чувајте цилиндри од свежа плакета до употреба

  1. Операција со каротидна ендартеректомија кај пациенти со или без исхемични симптоми (мозочен удар, минлив исхемичен напад) со значителна стеноза на каротидна форма, се изведуваат од васкуларни хирурзи и коронарна срцева ендартеректомија за време на операции на коронарна бајпас од страна на кардиохирурзи. Каротидните/коронарните плаки мора да се отстранат блокирани со цел да се зачува структурата на плаката, како што е опишано погоре 5.
  2. По искоренувањето на плаките, ставете го примерокот во средно исполнета цевка и чувајте го на мраз (плочата мора да биде целосно покриена со медиум) до употреба.

4. По одредено време на берба на парчиња ткиво од плакета

  1. Шок замрзнување на парчињата плаки за изолација на mRNA и синтеза на cDNA (за детални информации видете Протокол Дел 5).
  2. Супернатантна течност и се чува на -20 ° C за анализа на ЕЛИСА.
  3. За западно размачкување, пресечете го и лизирајте го ткивото на плаката. Филтрирајте го лизатот преку уред со центрифугален филтер од 0,65 μm и 0,1 μm.
  4. Вметнете ткиво на плакета во ткиво-тек или парафин за боење на имунохистохемија.

5. Екстракција на РНК од култивирани парчиња плаки

  1. Користете TissueLyser за хомогенизација.
  2. Изолирајте ја РНК користејќи го комплетот (видете Табела за материјали) според упатствата на производителот.
  3. Одредете ја количината и квалитетот на РНК во примероците со помош на спектрофотометар.
  4. Користете го комплетот cDNA на Boehringer за обратна транскрипција во согласност со упатствата на производителот.
  5. За квантитативна PCR, користете, на пример, комплет PCR во реално време со SYBR Green.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Прво, ние покажуваме временски зависни промени во воспалителното соединение на нестимулираните културни атеросклеротични лезии, со квантитативна реакција на полимеразна верижна реакција (qRT-PCR) (Илустрација 1) анализиран. За време на одгледувањето на плаки може да се забележи зголемување на активноста на воспалителното лезивно опкружување. Не е пронајдена разлика по 3 часа наспроти без култура (податоците не се прикажани). По 8 часа плакетна култура, откривме само мала регулација на некои молекули, како што се IL-6, но не и на TNF-a и IFN-g, додека по 24 часа имаше пререгулација на разни молекули како што се TNF a, IL-6 и IFN- Г. Вреди да се одбележи дека колку подолго време е културата на плака, толку е поголема варијацијата во молекуларниот израз.

Второ, со цел да се демонстрира можноста за влијание врз воспалителното опкружување кај атеросклеротичните лезии, презентираме резултати од парчиња плаки со 1 μg/ml LPS за 3 часа, мерени со qRT-PCR (Слика 2) инкубирана. Нестимулираните парчиња плаки служеа како негативни контроли. Откривме дека ЛПС предизвика значително зголемување на степенот на активирање на воспалителното соединение во рамките на атеросклеротичните лезии. Различни цитокини (IL-6, TNF-a, итн.)., Сл. 2А-Б), Хемокини (CCL2 итн., Не е прикажано), адхезија (ICAM-1, не е прикажано), дестабилизирање на плаките (металопептидаза матрица 9 (MMP9), не е прикажано) и протромботични молекули (фактор на Вилебранд), 2С, Факторот на ткиво не е прикажан) беа регулирани со ЛПС инкубација.

Трето, за да се процени количината на протеини, нивоата на култивирани лезии беа анализирани со ЕЛИСА и ги нарушија ткивата на плаките со вестерн бот (Слика 3D). Во Слики 3А-Ц ние покажуваме анализа на ЕЛИСА на IFN-g, MCP-1 и TNF-a во супернатантот на култивираните примероци инкубирани со LPS или контрола 8 часа. Во прилог на анализата на Western blot (фосфорилирана) ERK 1/2 разбиено и ткиво на плакета лизирано, или со контрола на стимулирање на LPS и во Слика 3D прикажано.

Дискусија

Тука презентираме ex vivo модел на култура на плаки за да се испита влијанието на потенцијално релевантните супстанции врз биологијата на атеросклеротична лезија. Главната предност на овие ек виво методи е можноста за проценка на влијанието на супстанциите споменати врз воспалителните клетки и нивната интеракција помеѓу клеточните и воспалителните патишта и каскадите во рамките на човечките атеросклеротични лезии. Неколку корисни методи (на пример, RT-PCR, Western blot, имунохистохемија, проточна цитометрија, ELISA) помагаат да се создаде сеопфатна анализа на ефектите на супстанцијата од интерес врз воспаление на атеросклеротична лезија.

Воспалителните процеси кај атеросклерозата кај глувците се добро разбрани, исто така благодарение на моделите на глувци за прекумерна експресија или недостаток на одредени гени од интерес 11. Сепак, резултатите не секогаш одговараат тесно на луѓето 6-9,13. Атеросклеротичните глувци обично добиваат висока патолошка диета со холеЕстерол 6. Покрај тоа, познато е дека имунолошкиот систем помеѓу луѓето и глувците покажува значителни разлики 9,7. Овде презентираме ex vivo модел на култура на плаки што овозможува проучување на влијанието на супстанцијата од интерес врз инхибиторното соединение кај атеросклеротичните лезии на човекот, како што е опишано од Ниснер и сор. 14 прикажани. Покрај тоа, може да се користат разни дополнителни методи за да се анализираат резултатите од експериментот со култура на плаки, споредлив со студиите за мирис. Затоа, моделот ex vivo отвора можност за замена на студии за глувци in vivo во некои случаи, и може да претставува одличен метод за премостување на јазот помеѓу претпоставената молекула на атеросклероза во муринскиот систем и преводот во хуманата биологија.

Ex vivo човечкиот модел за атеросклероза не може да се спореди со експерименти со in vitro клетки. Клеточните линии можат лесно да се складираат и култивираат, но не се фенотипски и функционално идентични со примарните клетки. Свежи клетки може да се добијат со редовно црпење крв, но понекогаш е тешко да се одгледува и културата е предмет на многу фактори. Покрај тоа, со користење на експерименти со ин витро клеточна култура не е можно да се проучи влијанието на специфичните молекули врз инхибиторното соединение кај атеросклеротичните лезии. Така, ин витро експериментите се важни за почетниот (преведувачки) чекор за истражување на човечката биологија, но не и за понатамошна анализа на улогата на молекулата од интерес во концептот на човечка атеросклероза, особено меѓусебно дејство на клетките и влијание врз воспалителните каскади и патот во атеросклеротични лезии .

Монако и др. Воспоставен важен краткорочен систем на култура на клетки изолирани од човечко атеросклеротично ткиво 15. Користевте ензимска мешавина на колагеназа, еластаза и ДНаза. Овој метод овозможува истражување на експерименти со лезии на клетки-клетки, анализа на патот на сигналот и студии за трансфер на гени со аденовирусни вектори. Но, останува непознато како ензимската мешавина влијае на клетките, т.е. степенот на активирање, изразувањето на површинскиот маркер итн. Понатаму, прашање е дали резултатите од овие експерименти ги одразуваат реалните процеси во атеросклеротичните лезии. Покрај тоа, првобитната положба на клетките ќе биде уништена со ензимско мешање и системот за краткорочна култура ги има истите ограничувања како и за ин витро клеточните експерименти.

За специфични студии на популација на клетки или клетки во рамките на атеросклеротична лезија, можно е да се користи методот на микродисекција на ласерското снимање. Клеточното или клеточното соединение од интерес ќе се исече од ткивото со употреба на инфрацрвен или УВ ласер и може да се изврши РНК, ДНК или протеинска анализа. Микродисекцијата со ласерско апсење изгледа дека не ги оштетува клетките, експресијата на рецепторот на површината на клетката итн. Предноста на методот е анализа на клетка или место на интерес во атеросклеротична лезија. Но, не е можно дополнително да се проценат клетките како ин витро студии.

Ex vivo моделот се заснова на примероци од ендартеректомија. Употребата на атеросклеротични плаки добиени од различни лица може да резултира во поголеми степени на диференцијален состав на клетките и, според тоа, поголема варијација во нивото на гените/протеините од интерес. Затоа, важно е да се користат нефибросклеротични лезии 10 богати со липиди или комплицирани примероци на плаки бидејќи инфламаторниот одговор е значително помал кај фибросклеротичните лезии. Затоа, од голем интерес е да се процени морфологијата на плакета пред да се анализираат резултатите од експериментите со културата на плакета.

Покрај тоа, секој примерок од примерокот содржи различни фази на развој/прогресија на атеросклеротичната лезија од почетната дисфункција на ендотелот и акумулација на липидите до масните ленти и развој на некротично јадро до раскинување на плаки. Така, со цел да се минимизира хетерогеноста на ткивата на плаки, потребно е да се намалат маргините што обично претставуваат рани чекори на атерогенеза.

Не може да се исклучи дека одговорите за повреда на ткивата предизвикани од сечењето. Но, нашите експерименти со култура на ткиво на плаки покажаа споредлив генски израз на култивирана ткивна плоча со некултурна ткивна плакета. Значи, ова подвлекува дека сегашниот метод е добра алатка за проучување на воспалителното опкружување кај атеросклеротичните лезии.

Парчињата KulturPlaque се ограничени на период до еден ден. Ако ткивото на плакета се култивира повеќе од еден ден, варијацијата на резултатите драматично се зголемува. Покрај тоа, по 3 дена составот на плакетата и морфологијата се распаѓа.

Постојат ограничувања што мора да се имаат предвид при примена на овој модел. Ex vivo моделот е добар метод за проучување на воспалителното опкружување кај атеросклеротичните лезии. Сепак, важни компоненти недостасуваат во овој контекст. Не се применливи хемодинамички својства и системските влијанија се целосно отсутни. Понатаму, со овој метод е можно само да се проучат краткорочните промени, но недостасува долгорочна анализа поради колапсот на морфологијата на плаките.

Како заклучок, ние претставуваме метод што ќе биде корисен за истражувачите кои бараат да ги проучат потенцијалните нови молекули на воспаление на атеросклеротичната лезија кај човекот. Ex vivo моделот на култура на плаки не страда од разлики помеѓу имунитетниот систем на глувците и човекот, но ни дава можност да ја анализираме меѓусебната интеракција на клетките во контекст на атеросклеротични лезии и да дадеме можност да ги испитаме локалните воспалителни каскади и лезии на патиштата. Екс виво методот на култура на плаки опишан овде е лесен за употреба и е репродуктивен и може да помогне да се идентификуваат и потврдат новите механизми на болеста и терапевтски цели.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Откривање

Авторите не мора да откриваат никакви конфликти.