Цис-9, транс-11 конјугирана линолеинска киселина ги инхибира воспалителните процеси кај моделите на астма in vitro и in

1 ОД ИНСТИТУТ ЗА НУТРИЦИОНАЛНИ НАУКИ НА ФРЕДРИЧ-ШИЛЕР-УНИВЕРЗИТЕТ ЈЕНА ЛЕРСТУЛ НУТРИЦИОНАЛНА ФИЗИОЛОГИЈА Цис-9, транс-11-конјугирана линолеична киселина ги инхибира воспалителните процеси во моделите на астма ин витро и ин виви Фармацевтски факултет на Универзитетот Фридрих Шилер во Јена од Анке Магдалена Јаудзус од Мехерштет Јена, 2008 г.

конјугирана

2 рецензенти: 1. Проф. Герхард Јахреис 2. Проф. Стефан Лорковски 3. Проф. Д-р Светилки од Алфонсо Датум на расправа: 26 февруари 2009 година

3 Моите родители Анемари и Дитмар и сите деца во ЦЛА студијата

4 СОДРИНА Список на кратенки V список на слики VII список на табели IX 1 Вовед Дефиниција на бронхијална астма и епидемиологија Дијагноза патофизиологија имунолошки основи Синтеза на CLA Бактериски хемиски физиолошки ефекти Рецептори активирани со пролифератор на пероксизом (PPAR) Членови на семејството PPAR Структура Контрола на изразување на гени PPAR и воспаление на дишните патишта CLA развиваат антиинфламаторни ефекти преку PPARs Хипотеза на целите Специјална цел Дел I: Имунологија Ин витро модел Ин виво модел Дел II: Метаболизам Материјал и методи Ин витро модел Клеточни биолошки методи Стимуланси и инхибитори Масни киселини PPARγ антагонист GW липополисахарид Z elllinie BEAS-2B одгледување долгорочно складирање стимулација на изолација на BEAS-2B и прочистување на еозинофили проток цитометрија кокултура на BEAS-2B и еозинофили И.

7 СОДРИНА 9.4 Вклучување на c9, t11-cla во BEAS-2B по 24 часа откривање на t7, c9- и t8, c10-cla во c9, t11-cla-врв Дополнето масло: c9, t11-cla богато со триазилглицерол Дополнето масло: CLA-Mix Триазилглицерол Дистрибуција на масни киселини по диета богата со маслиново масло Декларација Пофалници Публикации и придонеси за конференции CV IV

28 ВОВЕД (Чин и др. 1994). Меѓутоа, бидејќи повеќето од истрагите биле извршени со изомерни мешавини кои содржеле c9, t11-cla и t10, c12-cla во приближно еднакви делови и мали количини на други изомери, набудуваните ефекти не може јасно да се доделат на едниот или на другиот изомер. Подобрените методи на синтеза за репрезентација на одделните изомери сега овозможуваат многу порафиниран увид во сосема различните, а понекогаш и контрадикторни начини на дејствување на c9, t11-cla и t10, c12-cla (Таб. 2 и 3). 16

48 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ Откривање на ензимски реагенс: Секундарно антитело: биотинилиран анти-хуман IL-8 mAb (клон G 265-8, БД Фарминген): 1 μg/ml во блокирачки пуфер Avidin-HRP (BD Pharmingen) 1: 1000 во блокирачки пуфер Реагенс на супстрат: ТМБ 1: 100 во тампон Галати ТМБ: 240 мг 3,3,5,5 -ТМБ (Флука, Ној-Улм, Д) 5 мл ДМСО (Сигма) 5 мл етанол Галати пуфер: Пуфер на цитрат: Стоп Раствор: 0,034% H 2 O 2 (Merck) во цитратски пуфер 33,6 g лимонска киселина монохидрат во 400 ml дестилирана вода. се раствора со 4 N KOH прилагодете се на ph 3,95, со дестилирана вода. сочинуваат до 500 ml 1 M H 3 PO 4 (сите Merck) ELISA за квантифицирање на ECP ЕЛИСА за откривање на ECP е извршена со употреба на комерцијално достапен комплет (MBL, MoBiTec, Göttingen, D) според препораките на производителот. 96 плочи со микробразови вклучени во комплетот беа веќе обложени и растворите беа подготвени за употреба или беа подготвени според упатствата. Границата за откривање на овој комплет беше 0,125 ng/ml. 36

49 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ Ин виво модел Femaleенски BALB/c се добиени од Харлан Винкелман (Борхен, Д) и биле стари 6-8 недели кога биле примени. Сите експерименти беа одобрени од Државниот завод за безбедност при работа, здравствена заштита и техничка безбедност Берлин (LAGetSi) како продолжение на постоечката апликација за експерименти врз животни (Рег G 0247/03) според германскиот Закон за заштита на животните. 3.4 Дополнети со храна CLA масла C9, t11-CLA-богати со триазилглицерол (Таб. 6, Слика 13) се изврши со употреба на методот на конвертирање на метил рицинолат () и подготовката на CLA-Mix (Таб. 6, Слика 13) Базно-катализирана изомеризација на линолеинска киселина произведена врз основа на масло од сафлоран (обајцата Когнис, Илертисен, Д). Табела 6: Состав на масни киселини на препаратите CLA. Анализа на ГК. Масна киселина [% FSME] c9, t11-чиста мешавина на TAG CLA TAG C14: 0 0 0 C16: 0 0,2 2,6 C18: 0 0,5 2,8 C18: 1c9 1,8 14,4 C18: 1c11 0,3 0,7 C18: 2n6 3,1 0,3 C18: 3n3 0,2 0 C20: 0 0,1 0 C20: 1 0,5 0 C20: 5n3 0,4 0 CLA 86,6 78,0 Друго 6,7 1,4 Кратенки: метил естер TBE масна киселина, TAG триазилглицерол 37

50 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ A c9, богат со t11-cla, DAY B CLA мешавина DAY 1,4% 0,3% 0,4% 22,1% c9, t11-cla 0,1% 0,4% c11, t13 -cla t10, c12-cla c9, c11-cla t9, t11-cla 45,0% 52,6% 74,9% Сл. 13: Распределба на изомерите на CLA препаратите. A: c9, T11-богат со ТАГ. Б: CLA-Mix DAY. Прикажан е процентот на вкупниот CLA. Анализа на HPLC (9,5) Режим на хранење По 5 дена прилагодување кон условите за домување (22 ° C, 12-часовен светлосен/темен циклус, максимум 5 животни/кафез во системот на полици ИВЦ), животните беа случајно распоредени во тест групите. Пробните диети се засноваа на диетата за одржување V1535 од ssniff (Soest, D) и беа специјални нарачки што беа збогатени со соодветните масла (Таб. 7). Табела 7: Состав на масни киселини во тест диетите [g/kg]. Основна контрола на добиточната храна Примарна контрола на превенцијата Секундарна превенција c9, t11- CLA CLA-Измешајте масна киселина Додадено масло 1,5% сончогледово масло d, 3% маслиново масло d, 5% сончогледово масло 1,5% c9, t11-јасен TAG C14: 0 0,1 0, 1 0,1 0,1 0,1 0,1 C16: 0 4,7 5,6 5,0 5,6 4,7 5,1 Ц18: 0 0,8 1,4 1,2 1,4 0,9 1,2 C18: 1c9 6,2 10,0 16,1 10,0 6,5 7,7 C18: 2n6 18,0 27,8 18,8 27,8 18,4 18,3 c9, t11-cla, 9 5.0 c9, c11-cla, 9 0,1 t10, c12-cla, 9 C18: 3n3 2,3 2,5 2,4 2,5 2,5 2,3 C20: 0 0, 1 0,1 0,2 0,1 0,1 0,1 C20: 1 0,2 0,2 ​​0,2 ​​0,2 ​​0,3 0,2 0,20 C20: 4n Друго 0,3 0,3 0, 3 0,3 0,7 0,3 1,3% CLA-Mix ДЕН 38

56 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ Табела 9: Буквари и сонди што се користат за засилување на PPARγ. Буквар за ген нуклеотиди со низа FW 5 -TAA CTG CCG GAT CCA CAA A-3 PPARγ RV 5 -ATC TCC GCC AAC AGC TTC T-3 сонда 5 fam-ctg TCG GTT TCA GAA GTG CCT TGC-3 tam буквар FW 5 -GTT TGA GAC CTT CAA CAC CCC A-3 act-актински прајмер RV 5 -GAC CAG AGG CAT ACA GGG ACA-3 сонда 5 vic-cca TGT ACG TAG CCA TCC AGG CTG TG-3 tam 10 μl шаблон (100 ng) се додадени на 40 μl од оптимизираната мешавина на реакција се пипетира (Таб. 8) и се анализира во три примероци на оптички плочки од 96 бунари (ABgene, Epsom, UK) во PCR систем во реално време (Применети биосистеми) со користење на следната програма за температура: Табела 10: Програма за температура за засилување на PPARγ. Циклуси на време на температура [C] минута мин. S 60 1 мин. 40 Серија на разредување од вкупна РНК извлечена од ЛА-4 клетки е вклучена како внатрешен стандард во секое испитување. Биохемиски методи на протеини ЕЛИСА за одредување на ИЛ-5 во БАЛ. Состав на растворите: Обложување: Примарно антитело: Анти-глушец IL-5 mAb (клон TRFK5, BD Pharmingen): 2 µg/ml во пуфер за обложување Тампон за премачкување: 8,4 g NaHCO 3, во 1 литрирана вода . растворете се, прилагодете се на pH 8,2 со 10 N NaOH пуфер за миење: 0,05% Tween 20 во PBS 44

62 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ АНОВА). Бидејќи само главните ефекти на диетите може да се толкуваат за овој параметар, разликите помеѓу групите беа утврдени со непарирани Т-тестови на Студент. Кривите P enh беа проценети со помош на ANOVA за повторени мерења. Споредбата на c9, t11-cla OVA групи со и без GW9662, како и податоците од секундарниот пристап на превенција и ткивната концентрација на масните киселини беше извршена со помош на еднообразна анализа на варијанса (ANOVA). Влијанијата на диетите врз составот на масни киселини на испитуваните органи беа оценети со анализа на корелација. Прагот на значење е поставен со веројатност за грешка од 5% (стр 0,05). 50