Дисертација. да се добие академска диплома доктор земјоделски науки (д-р агр.) од дипломиран земјоделски инженер Питер Шкуфца

1 од Институтот за нутриционистички науки (директор: проф. Д-р Хабил К. Едер) на Земјоделскиот факултет (декан: проф. Д-р агр. Хабил В. Мербах) од Универзитетот Мартин Лутер Хале-Витенберг Експериментални студии за влијанието на оксидираните масти на избраните параметри на тироидниот хормон и метаболизмот на липидите кај моделот животински стаорец Дисертација за добивање на академски степен доктор земјоделски истражувач (д-р агр.) од дипломиран земјоделски инженер Питер Шкуфца урна: nbn: de: gbv: [Halle/Saale 2002

академска

2 од Институтот за нутриционистички науки Експериментални истражувања за влијанието на оксидираните масти врз избраните параметри на метаболизмот на тироидниот хормон и липидите кај моделот животински стаорец Земјоделскиот факултет на Универзитетот „Мартин Лутер“, Хале-Витенберг, како дисертација за добивање на академска диплома доктор земјоделски науки (д-р агр.) презентиран од дипломиран земјоделски инженер Питер Шкуфца, роден на 6 јуни 1971 година во jубjана, Словенија Рецензент: 1. Проф. хабил Едер 2. ПД Др. habil Brandsch 3. Проф.д-р. Хабил Хареис Декан: Проф. Др. агр. Хабил. Одбрана на В. Мербах на 1 јули 2002 година Хале/Зале 2002 г.

3 Содржина Список на табели Листа на фигури Список на употребени кратенки Страна I III IV 1 Вовед 1 2 Материјал и методи Тест поставување Истражување на влијанието на оксидираните масти врз метаболизмот на липидите и тироидните хормони со различно снабдување со селен Состав на диета Параметри на анализа Истражувања за влијанието на оксидираните масти врз 9 тироидниот хормон и метаболизам на липиди со различно снабдување со јод Состав на диета Параметри за анализа Истражувања за влијанието на различно термички третираните 13 масти врз концентрациите на тироидните хормони со различно снабдување со витамин Е Состав на параметрите за анализа на диета Чување на животните што се испитуваат Добивање и обработка на примерокот материјал Добивање плазма, еритроцити и отстранување на органи Фракционирање на липопротеини Добивање хомогенат на црниот дроб и цитозол на црниот дроб Аналитички методи Определување на индексот на маснотии за Absc Проценка на 20-от степен на оксидација на мастите број на пероксид Киселина број 20

9 III Список на бројки Список на слики Сл. - Содржина бр. Страна 1 Реакција на малондиалдехид со тиобарбитурна киселина 21 (според Валензуела, 1991) 2 Одредување на времето на заостанување според Клајнвелд и сор. (1992) 32 3 Принцип на индиректно определување на активноста на глутатион пероксидаза 33 4 Одвојување на производи за PCR со помош на електрофореза со гел од агароза

16 5 2 Материјал и методи 4,4% (w/w). Со цел да се отстранат ефектите од различниот состав на масни киселини на тест мастите, составот на масни киселини на свежо сончогледово масло се совпадна со моделот на масни киселини на оксидираната маст со додавање на 20% маст. Линолеинска киселина (18: 2 n-6) беше ориентационата вредност (54,1 g/100 g масни киселини) (Табела 1). Табела 1: Карактеризација на мастите користени во првиот експеримент Почетни масти Сончогледово масло Свинска маст Тест масти Свежо оксидиран извор на маснотии [g/kg диета] Сончогледово масло Свинска свинска маст Температура [C] Време [седмици] Масни фигури Број на пероксид [meq O 2/kg маснотии] 2,00-4, TBARS [μmol/kg маснотии] 0,29-0,27 0,34 киселински број [mg KOH/g маснотии] 0,55-0,57 1,44 состав на масна киселина [g/100 g масни киселини] миристична киселина (14: 0) 0, 1 1,6 0,4 0,1 палмитинска киселина (16: 0) 6,3 26,7 10,6 7,4 палмитолеинска киселина (16: 1) 0,1 2,3 0,5 0,1 стеаринска киселина (18: 0) 4,0 16,8 6,7 4,7 олеинска киселина (18: 1) 22,0 38,5 25,4 26,4 линолеинска киселина (18: 2 н-6) 65,8 9,3 54, 1 54,1 арахидинска киселина (20: 0) 0,3 0,0 0,2 0,3 еикосеноична киселина (20: 1) 0,3 0,8 0,4 0,3 токофероли [mg/kg маснотија] α-токоферол еквивалент на ара-токоферол ацет-рак-α-токоферол (додаток) α-токоферол [mg/kg], кратенки: KOH, калиум хидроксид; ЦЕБРИ, реактивни супстанции на тиобарбитуринска киселина.

21 10 2 Материјал и методи Табела 6: Карактеризација на мастите употребени во вториот експеримент Почетни масти Тест масти Сончогледово масло Палмино масло Свежо оксидиран извор на маснотии [g/kg диета] Сончогледово масло Палмино масло Температура на третман [C] Време [недели] Масни фигури Број на пероксид [meq O 2/kg] 2, 0-4, TBARS [μmol/kg] 0,29-0,27 0,34 киселински број 0,59-0,61 1,30 состав на масни киселини [g/100 g масни киселини] миристична киселина (14: 0) 0,1 1, 2 0,2 ​​0,1 0,1 палмитинска киселина (16: 0) 6,3 45,9 10,5 7,4 палмитолеинска киселина (16: 1) 0,1 0,1 0,1,1,0 стеаринска киселина (18: 0) 4,4 4,5 4,4 4,7 олеинска киселина (18: 1) 22,4 37,7 24,3 26,9 линолеинска киселина (18: 2 n-6) 66,2 9,5 59,8 60, 1 арахидинска киселина (20: 0) 0,3 0,4 0,3 0,3 еикосеноична киселина (20: 1) 0,2 0,2 ​​0,2 ​​0,3 токофероли [mg/kg маснотии] α-токоферол, се- еквивалент на рак-α-токоферол ацетат (додаток) α-токоферол [mg/kg], кратенки: TBARS, реактивни супстанции на тиобарбитуринска киселина.

25 14 2 Материјал и методи Табела 10: Карактеризација на мастите користени во третиот експеримент Започнување на маснотии Тест масти FF маснотии # 1 маснотии # 2 маснотии # 3 Извор на маснотии [g/kg диета] Сончогледово масло Свинска свинска маст Температура [C] Време [часови] Производи за пероксидација во маснотии Број на пероксид [meq O 2/kg] 1,6 1,5 TBARS [μmol/kg] 0,08 0,13 10,3 2,18 0,29 состав на масни киселини [g/100 g масни киселини] миристична киселина (14: 0) 0, 8 1,1 0,9 1,0 0,9 палмитинска киселина (16: 0) 15,2 13,2 17,4 17,8 17,5 палмитолеинска киселина (16: 1) 1,5 1,3 1,6 1,6 1,5 стеаринска киселина (18: 0) 8,7 11,5 9,8 10,4 10,2 олеинска киселина (18: 1) 33,4 35,6 36,9 35,6 34,7 линолеинска киселина ( 18: 2 n-6) 36,6 26,1 26,9 26,6 27,2 линоленска киселина (18: 3 n-3) 0,5 0,6 0,3 0,3 0,3 еикосеноична киселина (20: 1) 0,7 0,8 0,7 0,7 0,8 Токофероли [мг/кг маснотии] α-токоферол (анализирано), 9 цело-рак-α-токоферол ацетат Низок додаток - 71, Зголемен еквивалент на а-токоферол на додаток [ mg/kg маснотии] (пресметано) Низок додаток Зголемен додаток Кратенки: FF, Свежи маснотии; Маснотии # 1, маснотии загреани на 50 C; масти # 2, масти загреани на 105 C; Маст # 3, маснотии загреани на 190 ° C; ЦЕБРИ, реактивни супстанции на тиобарбитуринска киселина.

27 16 2 Материјал и методи Табела 11: Состав на диета при трет обид Маст компонента свежа количина [g/kg] оксидирана количина [g/kg] скроб од казеин Сахароза Маст свежа од тоа: сончогледово масло свинска свинска маст * 50 * целулоза витамин премикс Минерален премикс ДЛ-метионин 2 2 * содржина на сончогледово масло и маст за оксидирани масти (маснотии # 1, маснотии # 2 и маснотии # 3). 1 витамински премикс на кг диета: 4000 I.U.ретинол; 1000 IU холекалциферол; 0,75 мг менадион натриум бисулфид; 5 mg тиамин хидрохлорид; 6 мг рибофлавин; 6 mg пиридоксин хидрохлорид; 15 mg Ca-D пантотенат; 30 мг никотинска киселина; 2,0 мг фолна киселина; 0,025 мг кобаламин; 0,2 мг биотин; 1000 mg холин хлорид, јачина 16,9 g. 2 минерални премикси по кг диета: 9,83 g калциум карбонат; 9,42 g ди-калциум фосфат; 4,87 грама магнезиум фосфат; 10,0 грама калиум сулфат; 0,87 g магнезиум оксид; 2,99 g натриум хлорид; 0,16 гр железен сулфат; 50,6 mg цинк оксид; 30,0 mg бакар сулфат пентахидрат; 24,2 mg манган оксид; 0,32 мг јоден калциум; 0,33 мг натриум селенит, сахароза 1,8 гр.

28 17 2 Материјал и методи Табела 12: концентрации на α-токоферол во употребените диети и класификација на тест-групите во третиот тест група Тип на маснотии а-токоферол ацетат α-токоферол витамин Е Анализиран додаток за кратенка Група [мг/кг диета] [мг/кг диета] I II свежо ниту 11,6 ± 0,95 25 FF/NE (25 mg/kg диета) .1 38,1 250 FF/EE III оксидирано 25 46,5 ± 2,21 25 ОД # 1/NE на IV 50 C ± 30, 4 250 ОД # 1/ЕЕ V оксидираат 25 25,4 ± 4,17 25 ОД # 2/СЕ на VI 105 Ц ± 40,5 250 ОД # 2/ЕЕ VII оксидираат 25 26,7 ± 1,64 25 ОД # 3/НЕ на VIII 190 С ± 7, ОД # 3/ЕЕ Кратенки: FF, свежи маснотии; ОД # 1, маснотии загреани на 50 C; ОД # 2, маснотии загреани на 105 C; ОД # 3, маснотии загреани на 190 C; ЕЕ, зголемено снабдување со витамин Е; НЕ, мало снабдување со витамин Е. Табела 13: Масни фигури на диетални масти во третиот експеримент како дел од готовата диета Група POZ [meq O 2/kg маснотии] ТБАР [mmol/kg маснотии] I 4,66 0,02 II 4,41 0,00 III, 7 IV, 1 V 329 2.21 VI 224 2.26 VII 39.2 0.15 VIII 37.7 0.21 Кратенки: POZ, број на пероксид; ЦЕБРИ, реактивни супстанции на тиобарбитуринска киселина.

32 21 2 Материјал и методи Пресметување на бројот на киселина: AN (mg KOH/g) = 56.1. Потрошувачка KOH (ml). Концентрација KOH (N) Тежина на маснотии (g) Тиобарбитурна киселина-реактивни супстанции Одредувањето на TBARS се заснова на методот на Сидвел и сор. (1954), изменета од Халивел и Гатериџ (1989) и Валензуела (1991). Ова определување се базира на реакцијата на две молекули на тиобарбитурна киселина (ТБА) и една молекула на малондиалдехид (МДА) под влијание на топлината во кисела средина (Слика 1). OH CHO O OH N 2 x + CH2 HN NH HS N OH CHO SN OH O NH S TBA MDA Слика 1: Реакција на малондијалдехид со тиобарбитуринска киселина (според Валензуела, 1991) За да се одреди количината на TBARS, крива за калибрација со 1,1, 3,3-тетраетоксипропан (TEP) создаден како стандард. 0,2 g маст или 0,2 ml стандард се мешаат со 4 ml хлороформ и 4 ml TBA реагенс (0,67% (w/v)) во дестилирана вода, разреден 1: 2 со глацијална оцетна киселина) и се тресат 4 мин. Откако ќе се одделат фазите, горната водена фаза се испушти со пипета и се загрева на 95 ° C. 30 минути. Апсорпцијата потоа беше измерена на 532 nm во стаклени кивети. Количината на TBARS во μмол е одредена со крива на калибрација и е поврзана со 1 кг маснотии.

36 25 2 Материјал и методи Дијаметарот на фоликулите и висините на епителот потоа беа измерени на дигитализирани слики што беа снимени со видео камера во боја на Sony 3CCD на Axioscope со зголемување од 200x (Зејс, Јена, Германија). Измерени се 30 дијаметри на фоликулите и висината на три поврзани епителни клетки по слајд (Seffner and Heller, 1979; Seffner, 1982). Евалуацијата беше извршена со помош на програмата за евалуација КС (Зејс, Јена, Германија). Табела 14: Шема на вградување во машината за вградување Фази на вградување Време на вградување (часови) 1 Етанол 70% I 1 2 Етанол 70% II 1 3 Етанол 80% 1 4 Етанол 90% 1 5 Етанол 96% I 1 6 Етанол 96% II 1 7 Етанол апс. Јас 1 8 етанол апс. II 1 9 Ксилен I 1 10 Ксилен II 1 11 Парафин I 2 12 Парафин II Најмалку 1 Табела 15: Отстранување на агенсот за вградување Чекор на отстранување Времетраење (мин) 1. Ксилен II Отстранување на парафинот 5 2. Ксилен II Отстранување на ксиленот што содржи парафин 5 3. Ксилен III Отстранување на последните траги на парафин 5 4. Ксилен: апс. На етанол. 1: 1 (v/v) отстранување на ксиленот 1 5. Абс на етанол. I Отстранување на ксиленот 5 6. Абс апс на етанол. II Елиминација на остатоците од ксилен 5 7 Абс апс на етанол. III Отстранување на остатоци од ксилен 5 8. Етанол 96% 1 9. Етанол 80% вода (деонизирана) Промена на неколку пати 5

40 29 2 Материјали и методи Тироидна пероксидаза Параметрите на реакцијата се прикажани во Табела 18. Табела 18: Параметри на RT-PCR за тироидната пероксидаза МРНА и секвенците на парите на буквари TPO (EMBL ID: RNTPO) Primer 1 5 CCA CAA AAG GCC GAG GTT CAA G 3 Primer 2 5 AAG GGC TGT GGC ATT TAT TCG TCT 3 Концентрација на прајмер ЦДНА синтеза (Redy To Go TM RT-PCR Beads, Amersham Pharmacia) GAPDH (EBMI ID: RNGAPDHR) Primer 1 5 GCA TGG CCT TCC GTG TTC C 3 Primer 2 5 GGG TGG TCC AGG GTT TCT TAC TC 3 TPO - 1,0 pmol/μl мешавина на пар на прајмери GAPDH - 1,0 pmol/μl мешавина на пар на буквар 34 μl РНаза-бесплатна ултрачиста вода 1 μl олиго pd (Т) (12-18) (0,5 μg/μl) 5 μl РНК примерок (0,2 μg/μl) Сериите беа измешани а ЦДНА се синтетизираше за 25 мин на 42 ° С. Потоа, cdna беше денатуриран на 95 ° C за 4,5 мин. PCR реакција (Фармација) (Redy To Go TM RT-PCR Beads, Amersham Pharmacia) 40 μl мешавина на денатурирана реакција (синтеза на ЦДНА) 5 мл мешавина на пар на буквар TPO 5 микролии GAPDH мешавина на пакет-пакет Сериите се мешаа и се изведуваа за 42 циклуси (95 C, 30 сек. Денатурирање; 60 ° C., 30 сек. Прицврстување на прајмер; 72 ° C., 45 сек. Засилување на прајмер) извршено. Кратенки: GAPDH, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа; TPO, тироидна пероксидаза; EMBL ID, идентитетски број на редоследот на мрна во Европската лабораторија за молекуларна биологија.

43 32 2 Материјал и методи Параметри на антиоксидативниот систем за заштита Концентрацијата на α-токоферол во плазмата и црниот дроб е утврдена како параметар на системот за антиоксидативна заштита. Времето на заостанување е определено како параметар на чувствителноста на оксидација на ЛДЛ. Покрај тоа, утврдена е активноста на GSH-Px што содржи селен во цитозолот на црниот дроб и активноста на супероксид дисмутазата (СОД) во еритроцитите Одредување на концентрацијата на α-токоферол во плазмата и црниот дроб Претпоставувајќи 0,05 g црн дроб и 200 μl плазма, концентрацијата на α- токофероли според методот на Балц и сор. (1993) и Коорс (1991) утврдени (види Поглавје 2.3.2) Осетливост на оксидација на липопротеини со мала густина Сензитивноста на оксидација на ЛДЛ е утврдена како време на заостанување засновано врз методот на Естербауер и сор. (1989) утврден. Времето на заостанување се дефинира како интервал (мин) помеѓу почетната точка на мерењето и пресекот на права линија (а) на почетната апсорпција и тангентата (б) во регионот на линеарното зголемување на кривата на апсорпција (Клајнвелд, и сор., 1992) ( Слика 2). 1,0 Апсорпција на 234 nm 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Време на застој [min] Слика 2: Одредување на времето на заостанување според Kleinveld et al. (1992)

49 38 2 Материјал и методи беа започнати. Сите тест медиуми се загреваа на температура од 25 C пред да се утврди и зголемувањето на истребувањето потоа се мери на 339 nm и 25 C за 1 мин на спектрометар (Pharmacia Biotech, Фрајбург, Германија). Празната вредност беше искористена за да се коригираат вредностите на примерокот; неспецифичното формирање на NADPH/H + беше утврдено без додавање на малонил-CoA и одземено од вредноста на примерокот. Активноста FsS е пресметана со користење на равенката опишана во Поглавје Определување на релативната концентрација на мрна на липогените ензими во црниот дроб Вкупната РНК е утврдена со употреба на методот на гванидиниум тиоцијанат од Чиргвин и сор. (1979) изменета по изолирање на Чомачински и Саки (1987) со реагенс РНАзол Б (WAK Chemie Medical, Bad Soden, Германија). Букварите G6PDH, FsS и GAPDH беа утврдени врз основа на методот на Köhler (1995) и беа спроведени кинетичките студии (види поглавје).