Дисертација за добивање на академски степен на

Хаплотипи на генот на рецептори на витамин Д како фактори на подложност на колоректален карцином, како и анализа на ин витро експресија на гени регулирани со витамин Д Дисертација за добивање на академски степен на доктор на природни науки (д-р. Рет. Нат.) Хемија, аптека на Слободниот универзитет во Берлин презентирана од Јана Флугге од Грајфсвалд ноември, 2008 година 1. Рецензент: проф. Матијас Ф. Мелциг 2 рецензент: проф. Спор за Ивар Корени на 26 февруари 2009 година

степен

Признанија што ги утврдија, извршија и оценија анализите на SNPlex. Особено би сакал да му се заблагодарам на Дипл. Биол. Сабрина Клар за спроведувањето на SNPlex, д-р. Solveigh Krusekopf за воспоставување и оценување на SNPlex и г-ѓа Ен Силфлоу и г-ѓа Дипл. Биол. Кристин Кростиц за секвенционирање на 3 SNP. Овој докторат беше финансиски поддржан од Федералното Министерство за образование и истражување (проект ИноРеџио, грант број 03I4507, фармакогеномска оптимизација на терапија со лекови и развој на лекови под-проект карцином на дебело црево) и Инвестициибанк Берлин (проект ПроФИТ, грант број 1013 3117, индивидуални фактори на ризик за карцином на дебело црево, земајќи ги во предвид полиморфните тестови за генетска асоцијација вклучувајќи голем број мутации). Би сакал да им изразам посебна благодарност на моите родители Др. Дипл.-Инг. Франк Флуж и Дипл-Инг. Евелин Флуж, сестра ми Дипл-хем. Сузана Флуж, баба ми Херта Флуж и баба ми и дедо ми Гинтер Баков и Кристел Баков ја изразуваат својата драгоцена поддршка за цело време на моето учење, од училиште, преку студии до докторат, и поддршка и охрабрување во сите подеми и падови Работа II

Содржина Содржина Признанија. I Содржина. III Список на кратенки. VII 1 Вовед. 1 1.1 Колоректален карцином. 1 1.1.1 Инциденца и смртност. 1 1.1.2 Патогенеза на секвенцата аденом-карцином. 1 1.1.3 Индивидуални и фактори на ризик во животната средина, диспозиција и изложеност. 2 1.1.4 Генетски фактори и предиспозиција. 4 1.2 Витамин Д. 5 1.2.1 Својства. 5 1.2.2 Метаболизам на витамин Д. 6 1.2.3 Врска помеѓу витамин Д и карцином на дебелото црево. 7 1.3 рецептор на витамин Д. 8 1.3.1 Структура, структура и појава. 8 1.3.2 Начин на работа. 10 1.3.3 Полиморфизми на генот на рецептори на витамин Д, асоцијации и молекуларна карактеризација. 11 1.3.4 рецептор на витамин Д поли (А) микросателит. 12 1.3.5 Полиморфизми на гени вклучени во метаболизмот на витамин Д. 13 1.4 Број. 14 2 Материјал и методи. 15 2.1 Материјали. 15 2.1.1 Студија за популации. 15 2.1.2 Мобилни линии. 18 2.1.3 Уреди. 18 2.1.4 Хемикалии. 20 2.1.5 Решенија. 23 2.1.6 Потрошен материјал. 23 III

Содржина 3 резултати. 57 3.1 Полиморфизми на ген VDR. 57 3.1.1 Клинички податоци. 57 3.1.2 Резултати од генотипизирање. 58 3.1.3 парови на генотип VDR. 59 3.1.4 Нерамнотежа на ВДР спојката. 60 3.1.5 VDR хаплотипови. 61 3.1.6 рецептор на витамин Д поли (А) микросателит. 63 3.2 Полиморфизми на гени вклучени во метаболизмот на витамин Д. 67 3.2.1 Клинички податоци. 67 3.2.2 Резултати од анализата на мултиплекс. 68 3.2.3 Корелации на генотипови. 72 3.2.4 Анализа на спојување. 72 3.2.5 Сложени генотипови и хаплотипи. 74 3.3 Анализа на генска експресија со RT-PCR. 77 3.3.1 Индукциски експерименти (модел на диференцијација). 77 3.3.2 Релативна квантификација на мрна. 78 3.3.3 Експресија на ген VDR во клетките Caco-2. 79 3.3.4 Експресија на генот CDH1 во клетките Caco-2. 80 3.3.5 Експресија на генот VDR во клетките SW480. 81 3.3.6 израз на ген CDH1 во клетките SW480. 82 3.4 Анализа на изразување на гени со микро-низи на GeneChip. 83 3.4.1 Анализа на кластери. 83 3.4.2 Анализа на податоци за регулирани гени (безбедносни нивоа). 84 3.4.3 Доделување на регулирани гени. 85 3.4.4 Заговор за распрснување. 85 3.4.5 Анализа на хиерархиска кластер. 86 3.4.6 Анализа на избрани гени регулирани со витамин Д. 88 4 Дискусија. 92 4.1 Полиморфизми на ген VDR. 92 4.1.1 Влијание на полиморфизмите на генските рецептори на витамин Д врз подложноста на колоректален карцином (студија за контрола на случај). 92 В.

Содржина 4.1.2 Влијание на нерамнотежата на врската, сложените генотипови и хаплотипови. 95 4.2 Полиморфизми на гени вклучени во метаболизмот на витамин Д. 100 4.3 Анализа на експресија на гени. 102 4.3.1 Интерпретација на резултатите од анализата на генската експресија со RT-PCR по индукција во клеточни култури (модел на диференцијација). 102 4.3.2 Технички проблеми и преносливост. 104 4.3.3 Избор на референтни и кандидати гени. 105 4.3.4 Контрола на квалитет и анализа на податоци за резултатите од микроренијата. 106 4.3.5 VDR и CDH1 израз по анализа на микро-низа. 106 4.3.6 Интерпретација на резултатите од анализата на генската експресија со микро-низа GeneChip. 107 4.3.7 Модел на регулирање на гени со витамин Д. 112 4.4 Изгледи и перспективи. 113 5 Резиме. 114 6 Библиографија. 118 7 Список на публикации. 132 CV. 134 Доверба. 135 VI

Список на кратенки Список на кратенки Кратенки Acc. Не ACTB ATRA β-me bp BMI BSA CDH1 CDS CI crna CV CYP CYP24A1 CYP27A1 CYP27B1 d ddntp DMEM DMSO ДНК dntp dsdna EDTA EtOH fcrna FCS Што значи пристапен број бета-актин сите-транс-ретинота киселина бета-беталова киселина бета-бетал Индекс на телесна маса Серумски албумин говедско кодирање на секвенца Е-кадерин Интервал на доверба комплементарна РНК Коефициент на варијација Цитохром П-450 Цитохром П-450 24А1 (цитохром П450, семејство 24, подфамилија А, полипептид 1), витамин -Д 3-24-хидроксилаза цитохром П-450 27А1 (цитохром П450, семејство 27, подфамилија А, полипептид 1), витамин Д 3-25-хидроксилаза цитохром П-450 27А1 (цитохром П450, семејство 27, подфамилија Б, Полипептид 1), 25-хидроксивитамин-Д 3-1-алфа-хидроксилаза ден 2,3 -дидеоксинуклеотиди Дулбеко модифициран орел медиум диметил сулфоксид деоксирибонуклеинска киселина деоксирибонуклеотид 5 трифосфат двонасочена ДНК етилен диамин тетраацетат етанол фрагмент фтагмент фатгмент етанол фетагмент m (серум од фетално теле) VII

Список на кратенки g g GAPDH gdna Gl. h hap hm ht HWE погл. kb KG LD M MAF MES mrn mut MW n N.A. NaB NaCl н.д. НР н.с. nt OD или PBS PCR QC гравитационо забрзување грам глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа геномска ДНК-равенка час хаплотип хомозиготна хетерозиготна рамнотежа на Харди-Вајнберг поглавје килобазни парови комплексни генотипови спој на нерамнотежа РНК (гласник РНК) мутирана просечна вредност на големината на примерокот не е наведено натриум бутират натриум хлорид што не се забележува нуклеарни рецептори не се значајни нуклеотиди коефициент на оптичка густина коефициент на фосфат раствор на солена полимераза верижна реакција Контрола на квалитет VIII

Список на кратенки r Коефициент на корелација РАР рецептор на ретиноична киселина РНК рибонуклеинска киселина RFLP ограничување на должина на фрагмент полиморфизам RLT пуфер, содржи многу денатурирачки гуанидин изотиоцијанат (GITC) вртежи во минута во минута (вртежи во минута) ROH ретинол рна рибозомална РНК РТ-обратен транскрипт Сведберг (единица, коефициент на седиментација) SD стандардна девијација (стандардна девијација) секунди секунди ssdna едножична ДНК (единечна нишка) SNP единечен нуклеотиден полиморфизам Taq Thermus aquaticus TBE Tris-borate-EDTA пуфер Трис-ЕДТА пуфер Трис Трис- (хидроксиметил ) -аминометан транс-транс-РНК единица единица, единица УВ ултравиолетова светлина VDR витамин Д рецептор со див тип 1α, 25 (ОХ) 2 Д 3 витамин Д, 1,25-дихидроксивитамин Д 3, калцитриол 3 -, 5 -УТР 3 -, 5 - непреведен регион 7-DHC 7-дехидрохолестерол IX

Материјал и методи обезбедени од институтот ggmbh i.gr., Берлин-Хенигсдорф. Преглед на карактеристиките на туморот и класификацијата на TNM е даден во Табела 3. Табела 3 Локација на тумор, хистологија на тумор и класификација на TNM кај 452 пациенти со карцином на дебело црево (група II) Локација на тумор n% Caecum 32 7.1 Асцендентно дебело црево 51 11.3 Попречно дебело црево 26 5.8 Опаѓачки дебело црево 16 3.5 Сигмоиден колон 102 22.6 Ректум 214 47.3 Друго 11 2.4 Хистологија на тумор Аденокарцином 414 91.6 Муцинозен аденокарцином 28 6.2 Друго 10 2.2 Степен на диференцијација Лош 78 17.2 Умерен 330 73.0 Добро 31 6,9 Недиференциран 13 2,9 Стадиум на тумор (точки) pt1 Субмукоза 22 4,9 pt2 Muscularis propria 109 24,1 pt3 Субсероза 267 59,1 pt4 Други органи/перфорации 54 11,9 Метастази на лимфните јазли (pn) pn0 Без метастаза 211 46,7 pn1 1-3 лимфни јазли 126 27,9 pn2 4 или повеќе лимфни јазли 102 22,5 Други 13 2,9 Далечни метастази (попладне) попладне0 Нема далечни метастази 346 76,6 pm1 Далечни метастази 100 22,1 Други 6 1.3 Контролната група се состоеше од пациенти со не-малигни заболувања. Примероците беа собрани од Институтот за клиничка фармакологија и токсикологија при Charité Universitätsmedizin Berlin. Сите учесници во студијата беа информирани за содржината и целите на студијата и дадоа писмена согласност. 17-ти