ЕКСПЕРИЕМЕНТНО СТУДИЈА ЗА IMИВОТНИТЕ ВО ВИВОТЕСТИРАЕ НА БИО-ГРАДИБИЛО ПОСТАПЕН ФАРМАКОН
1 Клиника и поликлиника за општа, торакална, васкуларна и трансплантативна хирургија на Медицинскиот универзитет во Росток ИСПЕРИЕМЕНТАЛНА СТУДИЈА ЗА ВИВО ИСПИТУВАЕ НА БИОДЕГРАДИРАЕ НА БИОДЕГРАДИРАЕ НА ПОЛИЛАКТИД СТЕНТИ НА ФАРМАКОН Инаугуративна дисертација за стекнување со академски степен во Краснодар. Росток, 2007 урна: nbn: de: gbv: 28-дис
2 декан: проф. Д-р. med Волфганг Шарек 1-ви рецензент: 2-ри рецензент: 3-ти рецензент:
3 Како благодарност до моите родители
4 СОДРИНА. 1 1 ВОВЕД Стентови во васкуларна хирургија Воспоставени индикации и иновативно стентирање на каротидна артерија Идеален стент Метален стен Проблеми на имплантација на стент: Тромбоза и рестеноза Стратегии за решение Антитромботици Метален стент со ослободување на лек: Сиролимус Биоразградливи стенти Метален стент и полимерен стент со ослободување на лекови Стенти Тест на животни и предоперативно управување Анестезија, интубација и вентилација Следење и лекови Хируршка постапка Илијачна анастомоза модел ACC модел Постоперативно управување и следење Земање примероци и хистологија Статистичка проценка РЕЗУЛТАТИ Илијачна анастомоза модел Хируршка процедура Следи хистолошка проценка ACC модел Хируршка процедура Хистолошка проценка
5 5 ДИСКУСИЈА Модел на свињи Биолошки и физички својства на стентот PLLA Тестирање на стент со полимер in vivo РЕЗИМЕН ЛИСТ НА ЛИТЕРАТУРА ЛИСТА НА АБРЕВИЈАЦИИ СПИСОК СЛИСКИ СЛИГИ НА СЛИКИ НА ТАБЕЛИ НАУЧНА ПОСТАПКА СОСТАВНА ОДГОВОРНОСТ
12 Функцијата за поддршка на металниот стент во голема мера може да помогне во спречување на еластично повлекување, но не може да ја инхибира неоинтималната хиперплазија, што е уште еден одлучувачки фактор во патогенезата кај рестенозата на стентот [47]. Сл. 1: Рестеноза во стент поради неоинтимална хиперплазија, лево: хистолошки пресек, десно: макроскопска слика со пресек, [благодарност од МБ Леон, болница Презвитеријан, Newујорк, САД.] Ова ја покажува реакцијата на wallидот на крвниот сад на најдобрите механички лезии По навлажнување на ендотелот, изложеноста на субендотелијалните структури во крвотокот доведува до воспалителна реакција на васкуларниот wallид. Преку ослободување на цитокини и фактори на раст како што се фактор на раст добиен од тромбоцити (PDGF), епидермален фактор на раст (EGF), ß трансформирачки фактор на раст (TGF and) и хепаринази, ова доведува до активирање и размножување на мазните мускулни клетки во туниката медиуми. После 9
14 контролна група [52]. Локалната хепаринска обвивка на стентови е клинички утврдена уште од објавувањето на студијата БЕНЕСТЕНТ II [53] Метален стент со ослободување на лекови: Со цел да се намали неоинтималната хиперплазија, а со тоа и при рестеноза на стентот, има смисла да се користат терапевтски агенси локално. Овие би требало да ја инхибираат воспалителната реакција на wallидот на крвниот сад и да ја блокираат пролиферацијата на клетките на мазните мускули. Табела 1: фармаколошки агенси Анти-воспалителни за да се намали рестеноза Immunodulatoren анти-миграција инхибитори Proliferativa Reendothelisationsfaktoren дексаметазон M-преднизолон интерферон y-1b, лефлуномид, сиролимус, такролимус, еверолимус zotarolimus мукофенолна mizoribine циклоспорин актиномицин метотрексат angiopeptin, винкристин, митомицин статини batimastat пролил хидроксилаза инхибитори, халофугинон C-протеиназа инхибитори, пробукол BCP671 VEGF Естрадиол НЕ донатори EPC антитела 11
22 Степен на повреда на повредата на неоинтимална хиперплазија Степен на воспаление на васкуларниот Wallид Степен на воспаление Собраните податоци се анализираат, се споредуваат едни со други и се дискутира во врска со in vitro испитувањата на стентот PLLA, кои беа снимени на Институтот за биомедицински инженеринг на Универзитетот во Росток. 19-ти
23 3 МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДИ 3.1. Стентови Металните стентови (Phainon 6,0 x 26 mm, дијаметар на потпора 155 m) се изработени од не'рѓосувачки челик (316L) со аморфен слој од силициум карбид, а потоа се стерилизираат со гас. Дизајнот одговара на комерцијално достапниот систем PEIRON (Biotronik GmbH & Co. KG, Берлин, Германија). Проширувањето со катетерот за балони се одвива во рок од неколку секунди до 8 бари без ризик од прекин на стентот. Биоапсорбирачките стентови од поли-Л-лактид (PLLA) беа развиени и произведени во Институтот за биомедицинска технологија на Универзитетот во Росток Варнемунд [16]. Сл. 2: СТЛ-стент што може да се прошири со балони пред (A) и по (B) проширување на балонот Должина на шипката = 10 mm. 20-ти
24 За производство се користи поли L лактид со висока молекуларна тежина (PLLA; Resomer L214, MG = g/mol, Boehringer, Ingelheim, Германија) без адитиви. Во компјутерски контролиран, делумно автоматизиран процес на обложување (натопена обвивка), куќиштата на јадрото од не'рѓосувачки челик (дијаметар 2,8 mm, должина 40 mm) се спуштаат во раствор PLLA/хлороформ со помош на нуркачки робот. Решението автоматски се полни со помош на систем на шприц за да се осигура дека потопните јадра се рамномерно навлажни. Процесот на потопување се повторува сè додека не се создаде јакна со посакувана дебелина на wallидот од 270 m. Ова се мери без контакт со ласерска мерна глава со две оски (ODAC 32 XY, ZUMBACH Electronic, Orpund, Швајцарија). Полимерните цевки потоа се отстрануваат од клипот со скалпел и се сушат во вакуо на 40 C додека не се постигне содржина на хлороформ помала од 2%. Конечен процес на миење со вода и метанол се користи за отстранување на остатокот од хлороформ. Во вториот чекор, цевките потоа се сечат со употреба на ласер СО2 (Wild Emco Lasertec, Халејн, Австрија). Сл. 3: лево: нуркачки робот, десно: СО2 ласер 21
25 Намалувањето е контролирано од ЦНЦ. За фиксација, полимерните цевки се ставаат на керамички меур, што му овозможува на ласерот да се движи напред, назад и во ротација. Сите патеки за сечење се поминуваат двапати, така што материјалот е целосно пресечен. Конечниот резултат е стентови PLLA со големина од mm и дијаметар на потпора 270 m, кои се завршуваат во последниот чекор со прскање на раствор PLLA Sirolimus во сооднос 70:30, премаз за прскање на лекот. Сл.4: Обложување со прскање - прскање на растворот за обложување. Составот на растворот произлегува од прелиминарните тестови кои покажаа дека сиролимус се ослободува само во концентрација од најмалку 20% [16]. Како резултат на премазот Фармакон е околу 1,5 g/mm 2. Додека не се користи стентот, тој се чува на суво место на 20 C со цел да се продолжи рокот на траење. Бидејќи стерилизацијата е поврзана со намалување на вискоеластичните својства [15, 16], тоа не е направено. Едноминутната дезинфекција на стентот со етанол се одвива непосредно пред имплантацијата. 22-ри
31 Процесот на анастомоза го спроведува исклучиво ист хирург (Ц.М.Б.) со помош на призматично лупа со зголемување од 2,5x, со цел да се гарантира најголема можна стандардизација на хируршката техника. Сл.6: Имплантација на бифуркациона протеза аортобиилијакал; интраоперативен ситус. Имплантацијата на стент е рандомизирана. Паралелно со подготовките за стентот (3.1.), Проксималното (сатински стегач) и дисталниот екстремитет (булдог клешта) на заедничката илијачна артерија се стегнуваат на животното и приближно см проксимално на анастомозата. Двете страни на садот се испуштаат низ засекот и се исплакнуваат со сол на хепарин. По претходното истегнување со Оверхолт, стентот се стега на катетер со балони од 6/40 мм (PHERON, Биотроник, Берлин, Германија) се воведува во средината на областа на анастомоза и постепено се шири под визуелна контрола. 28
32 Сл. 7: Имплантација на стент под визуелна контрола Стентот се шири со надувување на катетерот со балон на 8 бари. Како што е опишано погоре, металниот стент се шири за неколку секунди, додека проширувањето на PLLA стентот трае 8 минути (1 бар/мин). По репозиционирање на катетерот, засекот потребен за пристап е затворен со конци со едно копче (Пролен 6,0 БВ) и заедничката илијачна артерија се изложува по отстранувањето на булдогот. Конечно, се проверуваат виталните параметри на животното. 29
33 Сл. 8: Инфлација на илијачниот анастомотски стент, кој е макроскопски видлив низ wallидот на крвниот сад. Откако успешно ќе се вметнат стентовите во садовите, артерискиот катетер се отстранува и аортата се затвора со Пролен. Следува интравенска администрација на 1,5 g ампицилин/сулбактам (Unacid) и плакнење на абдоменот со раствор на гентамицин NaCl, и за антибактериска профилакса. По отстранувањето на супрапубичниот уринарен катетер со затворање со Z шиење (Викрил 3,0 SH) и репозиционирање на цревните јамки, ретроперитонеумот постојано се отвора со 3,0. Шиење на викрил и перитонеумот затворен со Мерсилен. Поткожното конче се прави и со трчање 3.0. Викрилна шиење, кожата е зашиена со апсорбирачка нишка по дезинфекција со раствор на јодид. Покрај тоа, 40 mg еноксапарин (Clexane) и 5 ml антибиотик со широк спектар на окситетрациклин (Terramycin, Pfitzer Animal Health, Exton, USA) се администрираат поткожно во глутеалните мускули. 30-ти
35 се администрира еднаш наутро и навечер. Свињата се пренесува назад во куќата на животните. Доплер-сонографија: Доплер-сонографските прегледи на аортоилијачните садови се вршат интраоперативно (по протези и по имплантација на стент) и две и шест недели по имплантацијата. Максималниот проток на феморална артерија на крв (Fmax, khz) се одредува со употреба на техника на континуиран бран со цел да се проценат својствата на протокот на дисталната анастомоза. Сл. 9: Доплер-сонографски преглед на феморалниот проток на крв Компјутеризирана томографија: Со цел да се утврди проодноста на стентот со текот на времето, компјутерски томографски прегледи со помош на контраст (Томоскан АВ, Филипс Германија; Аквилеон TSX 101A, Тошиба, Германија) на аорто-илијачните садови се вршат по еден, два, четири и шест недели со употреба на волумен 32
36 техника на рендерирање (VRT), што овозможува истовремено прикажување на површини и структури и проекција на максимален интензитет (MIP), специјална техника за волуметриска визуелизација. Theивотните беа искористени за истраги како во 3.3. опишани, седативи. Сл. 10: КТ аорто-илијачен регион. Двата стента се континуирани. Голема стрела: метален стент, скршена стрела: стент PLLA (не радиопатно) Земање примероци и хистологија: За да може да се оценат васкуларните и периваскуларните делови во областа на стентот од хистоморфолошка и планиметриска гледна точка, делови на садовите што носат стент, како и преодните области кон протезата или кон мајчин сад се експлантира по период од 6 недели. 33
38 Ниво 1: Ниво 2: Ниво 3: Проксимално на стентот на анастомоза и протеза Шиење на анастомоза Дистал на стентот на анастомозата и садот Примероците од садот се сечат со дебелина на слој од 10 m, се валкаат во раствор на хематоксилин/еозин (H.E.) и се сушат. Хистопланиметрија: За да можат морфометрично да ги проценат хистолошките делови, тие се фотографираат со систем на дигитална камера за микроскопи (Axioskop 40, Axio Cam MRc5, Carl Zeiss, Хамбург, Германија) и се префрлени на компјутер. Сите делови се дигитализирани за планиметриски анализи и се проценуваат со софтверот Image J (верзија 1.32j) од веб-страницата на националниот здравствен институт (. За да се процени пост-интервентната проодност на садовите, дијаметарот на преостанатиот лумен (RL, mm) во нивоа 1, 2 и 3 во шест мерења, засновани на неоинтималната граница од страната на луменот, определена под агол од 60% и пресметана од аритметичката средина. Неоинтималната хиперплазија се определува од средната дебелина на интимото (СРД, мм), што е над стеблата на ниво 3 е измерена, утврдена 35
39 Хистоморфологија: Хистоморфолошката проценка ја вршат двајца независни испитувачи кои се ослепени од присуството на сиролимус во стентовите на PLLA. Резултат на повредите За полу-квантитативно да се процени степенот на повреда на васкуларниот wallид предизвикан од стентот, 4 последователни засеци дистални од анастомозата се испитуваат со помош на светлосен микроскоп и се создава индекс на повреди. Се проценува секоја индивидуална потпора на пресек и се доделуваат нумерички резултати (0 3): 0 ламина еластика интерна (ЛЕИ) непроменета, туника медија не компресирана, нема повреда 1 ЛЕИ недопрена или малку лацерирана, компресирана медиум, не лацерирана 2 ЛЕИ и tunica media lacerated, adventitia intact 3 lamina elastica externa (LEE) перфориран, адвентиција оштетен или перфориран. Сите резултати се собираат и се делат со бројот на проценети потпори за да се добие резултат на повреда за целиот стент [48]: Резултат за повреда (ИС) = збир на сите резултати, број на оценети потпори 36
40 Воспалителна оценка Оваа класификација на оценки се користи за евиденција на степенот и густината на реакцијата на воспалителното ткиво по имплантација на стент. За таа цел, секоја индивидуална потпора се испитува полуквантитативно за појава на воспалителни клетки во четири последователни засеци дистални од анастомозата и се издвојуваат нумерички резултати (0 3): 0 нема инфламаторни клетки 1 мала субинтимална инфилтрација на лимфоцити и хистиоцити 2 локални умерени до густи клеточни агрегати 3 густа инфилтрација на Лимфоцити и хистиоцити кои го опкружуваат целиот потпор Воспалителниот резултат за целиот стент произлегува од збирот на индивидуалните резултати поделени со бројот на оценети потпори [93]. IF = збир на сите оценки број на струја што се оценуваат 3.8. Статистичка проценка: основните параметри на работењето и хистолошките податоци се претставени во просечна девијација +/- стандардна девијација. Разликите се споредуваат статистички со користење на непариран двоопасен Т-тест. Претставата на мерењата на ултразвукот Доплер со користење на аритметичката средина. Податоците 37
44 Следење на доплер-сонографија: По имплантација на протезата, дополер-сонографијата со континуиран бран покажува намалување на амплитудата на систолниот проток на крв, што се враќа со имплантација на стент. По шест недели, немаше хемодинамичко намалување на феморалниот проток на крв во групата PLLA стентови обложени со метал и сиролимус. Спротивно на тоа, има намалување на Fmax во групата на PLLA стентови. Компјутеризирана томографија: Сите стентирани групи имаат отворен лумен на компјутерска томографија по 6 недели. Групата PLLA без облоги покажува неправилности кои укажуваат на стеноза. Спротивно на тоа, скоро непречен артериски проток може да се забележи во групата Сиролимус ПЛЛА. Проценката на луменот по стентирање на метал е проблематична бидејќи металот произведува артефакти во компјутерската томографија. 41
45 Сл.11: КТ аортоилна. И нозете на протезата и AIC се отворени (десен метал, лево PLLA). Во областа на стентот PLLA, постојат неправилности што доведуваат до умерено стеснување на луменот Хистолошка проценка Сите сегменти што носат стент се континуирани; Хистолошката проценка не покажува докази за прекумерно повлекување или колапс на стент. Неоштетен кружен засек може да се најде во сите примероци. 42
46 Сл. 12: Хистолошки дел кој покажува докази за стентови од отворен метал (*) и PLLA (**). Неоинтимална хиперплазија може да се забележи над стентските потпори (S), што е поизразено кај PLLA. HE боење, оригинално зголемување 12,5 x. Сл. 13: Хистолошки дел од СИР-ПЛЛА стент. Постои само минимална неоинтимална хиперплазија над стрент стените (С). е HE боење, оригинално зголемување 12,5 x. 43
50 Хистолошка проценка: сите стентирани сегменти покажуваат отворен лумен, немаше тромботска оклузија во тест сериите. Хистолошката проценка открива непроменет кружен засек на стентот во сите сегменти; нема индикации за прекумерно повлекување или колапс на стентот. Сл. 17: Хистолошки дел во областа на ACC, метал лево, PLLA десно. Може да се забележи формирање на неоинтима над стент-стрит (S), што е поизразено кај PLLA. HE боење, оригинално зголемување 12,5 x. 47