Екстрахепатична регулација на хепцидин зависен од железо - PDF бесплатно преземање
1 Универзитетски улмски болнички центар за интерна медицина Клиника за интерна медицина Јас медицински директор: проф. Д-р. медицински Томас Соферлејн, регулирање на екстехепатична хепцидин, зависно од железо, дисертација За добивање на докторска диплома по стоматологија на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Улм, претставена од Клара Рут, Фрида Брениг од Минхен 2013 година
2 Вршител на должноста декан: проф. Томас Вирт прв репортер: ПД Др. Павел Шрнад 2. Известувач: проф. Ден на промоција на Ларс Булингер:
4 Содржина Список на содржини Список на фигури Список на табели Список на кратенки III V VI 1 Вовед Ironелезо рамнотежа Изразување и структура на хепцидин Механизми на дејство на хепцидин Регулирање на хепатичен хепцидин Хепцидин во вонхепатични органи Цел на истражувачката работа Материјал и методи Материјали Хемикалии Пристапи на реакција и тампонски раствори Комплети Уреди Методи husbandивотинско производство Испитување на животни РНК од синтезата на прстите нишки на cdna ткиво Квантитативно PCR во реално време Определување на железо во ткиво Екстракција на протеини од ткиво Определување протеини Western blot Хистологија и боење Серумски феритин и определување на серумско железо Статистичка проценка I
5 Содржина 3 Резултати Концентрација на серумско железо и феритин по диети со малку железо и високо железо Ефект на диети со малку железо и високо железо врз црниот дроб Хепатална концентрација на железо Хепатално хепатално изразување Ефект на диети со малку железо и високо железо врз вонхепатични органи Ефект на диети со малку железо и високо железо врз слезината Диети со малку железо и високо железо на стомакот Ефект на диети со малку железо и високо железо врз панкреасот Ефект на диети со малку железо и високо железо врз бубрезите Ефект на диети со малку железо и високо железо врз дуоденумот Ефект на диети со малку железо и високо железо врз срцето Дискусија Системски параметри на железо во зависност од содржината на железо во спроведената диета Локална концентрација на железо во екстрахепатичните органи во зависност од содржината на железо во исхраната администрирана експресија на хепцидин на екстрахепатичните органи во зависност од спроведената диета Апстракт 53 Реф. индекс 54 Благодарница 63 Наставна биографија 64 II
8 Список на табели Листа на табели Табела. 1 Секвенци на буквар за анализа на RT-PCR Таб. 2 Ironелезо стандарден раствор Таб. 3 Шема за пипетирање за подготовка на гел Трицин-СДС-полиакриламид 22 Таб. 4 Примарни антитела Таб. 5 Секундарни антитела V
9 Список на кратенки Список на кратенки μ Micro ALK2/APS AS BMP (R) BPS BSA cdna dest DFO DMT DNA dntp DTT ECL GP 80/H 2 O HAMP Hepc1/HFE HJV IFN-γ IL-6 (R) M n NaCl активин рецептор-како Киназа 2/3 амониум персулфат аминокиселинска коска морфогенетски протеини (рецептори) батофенантролиндисулфонична киселина дисатриум сол телешко серум албумин комплементарна ДНК дестилирана десфероксамин дивалентен метал носител 1 деоксирибононуклеинска киселина деокси-нуклеотид трифосфатилтеоцитен интрахиноценетил2ацитен интрахиноценетил Рецептор) моларен нано натриум хлорид VI
10 Список на кратенки p PCR psmad qrt RNA rpm SDS SMAD STAT TBS TEMED Tf (R) TGF Tris V Пико Полимераза со реакција на синџири фосфорилирана SMAD Квантитативна круга на рибонуклеинска киселина за минута натриум Додецил сулфат спинална мускуларна атрофија и транс, N, N, N -Тетраметилетилендиамин 1,2-бис (диметиламино) -етан трансферин (рецептор) Транс-трансформиран фактор на раст Tris- (хидроксиметил) -аминометан Волт VII
19 1 Вовед Органите, сепак, се главно неистражени. Различни студии досега покажаа дека различни фактори како што се Преоптоварување со железо, воспаление или хипоксија може да влијае на локалните изрази на хепцидин во нехепатични органи, но механизмот обично останува необјаснет. Со цел да се подобри разбирањето на регулацијата на екстрахепатичните хепцидини, оваа истражувачка работа го анализираше влијанието на преоптоварувањето на железо или недостаток на железо врз рамнотежата на железо и изразот на хепцидин во различни ткива. За таа цел, глувци од див тип биле користени како модел на модели и се хранеле со различни диети со железо. Влијанието на овие диети врз изразот на хепцидин потоа беше испитано на нивоата на РНК и протеини. Покрај тоа, се мери концентрацијата на железо во ткивата. 9
20 2 Материјал и методи 2 Материјал и методи Сите хемикалии, реагенси, комплети, материјали и уреди што се користат во оваа работа се наведени во следните списоци. 2.1 Материјали на хемикалии Акриламид АПС (амониум персулфат) Л-аскорбинска киселина β-меркаптоетанол Батофенантролин дисулфонска киселина динатриум сол (БПС) Бисакриламид Бовински серумски албумин (БСА) реагенс Бредфорд Бромофенол сино Dithiothreitol (DTT) ECL Sigma Aldrich Chemie GmbH, Минхен Био Рад, Laboratories Gmbh, Минхен Сигма-Олдрих Chemie GmbH, Минхен Carl Roth GmbH + CO. KG, Карлсруе Сигма-Олдрих Хеми ГмбХ, Минхен Сигма Олдрих Чеми ГмбХ, Минхен Серва Електрофореза ГмбХ, Хајделберг БИО-РАД Лаборатории ГмбХ, Минхен Сигма Олдрих Хеми ГмбХ, Минхен БИО-РАД Лаборатории Гмбх, Минхен ПегХаббам Емб Leon-Rot Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe Amersham Biosciences, Бакингемшир, Велика Британија 10
21 2 Материјали и методи Ironелезо III нехихидрат нитрат железо карбонат развивач еозин етанол фиксирачки раствор формалдехид глицерин глицин хематоксилин изопропанол калиум хексацијаноферат хлорид II нуклеарно брз црвен метанол нов остри протеини олиго (dT) 20-првично протеински протеини Master Mix SuperScriptIII Reverse Transcriptase Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Munich Tentenal AG & Co KG, Norderstedt Merck KGaA, Darmstadt Sigma Aldrich Chemie GmbH, Минхен Тетенл AG & Co KG, Nordershtmh Gordhrsthord GmbH Копродукции КГ, Карлсруе Карл Рот ГмбХ + Ко. KG, Карлсруе Мерк KGaA, Дармштат Сигма Олдрих Хеми ГмбХ, Минхен Мерк, Дармштадските векторски лаборатории, Бурлингем, САД Сигма Олдрих Чеми ГмбХ, Минхен Дако Дојчланд ГмбХ, Хамбург Инвитроген, Дармштат Рохелд Гхамјах, Генхам, Гнијам, Гнијам, Гнијам, Манијам Хилден Инвитроген ГмбХ, Дармштад 11
22 2 Материјал и методи Хлороводородна киселина TEMED (N, N, N, N -Тетраметил-етилендиамин) Трис- (хидроксиметил) - аминометан Туин20 ксилен монохидрат на лимонска киселина VWR International GmbH, Дармштат Карл Рот ГмбХ + Ко. КГ, Карлсруе Сигма Олдрих Чеми ГмбХ, Минхен Сигма Олдрих Чеми ГмбХ, Минхен VWR, Улм Мерк КГаА, Дармштат 12
23 2 Материјал и методи Реакција на серии и тампонски раствори Аскорбинска киселина Аноден пуфер Размачкувачки тампон BPS Coomassie Blue раствор DNase мешавина Раствор за екстракција Работен раствор за боење железо Буфер за полнење гел (5x) 0,088 g аскорбинска киселина 5ml H 2 O 24,22 g Tris и 1L H 2 O 3,03g Tris 11,26 g глицин 100 ml метанол реклама 1L дист. H 2 O ph 8,3 14,76 mg BPS 5 ml H 2 O 400 ml метанол 100 ml етаноична киселина 0,4 g Coomassie blue 250G и 1L дист. H 2 O 70 μl RDD 10 μl DNase/примерок 10mM Tris 0,5% Triton X-100 ph 7,5 100 ml 2% калиум хексацијаноферат II 100 ml 1% HCl 1M Tris 10% SDS 50% глицерин 25% β меркаптоетанол бромофенол сина 375 μm дист. H 2 O ph 6,8 13
24 2 Материјал и методи Редење тампон за гел Катоден пуфер Стандарден раствор за определување на железо Раздвојувачки гел-пуфер T40/C3 T40/C6 Трис-пуфер-солен раствор (TBS) Трис-пуфер-солен раствор со Tween (TBST) RLT пуфер + β ME мастер мешавина за cdna синтеза I 60, 5g Tris до 1L одд. H 2 O ph 6,8 12,11g Tris 17,92g трицин 10ml SDS ад 1L H 2 O 0,003607g железо III нитрат нехихидрат 1 ml H 2 O 1811,71g Tris ad 1L дист. H 2 O ph 8,8 7,76 g акриламид 0,24 g бисакриламид и 20 ml VE-H 2 O 18,8 g акриламид 1,2 g бисакриламид и 50 ml VE H 2 O 8,76 g NaCl 1,21 g Tris ad 1L дист. H 2 O ph 7,5 1L TBS 1 ml Tween20 10 μl 1% β меркаптоетанол 1 ml RLT (дел од RNeasy мини комплет) 1 μl Олиго (dT) 20-прајмер (0,2 μg/μl) RNA (2 μg) 1 μl dntp-мешавина (10mM секој) ) реклама 14 µl вода без РН-14
25 2 Материјал и методи Master-Mix за cdna-синтеза II Master-Mix за RT-PCR Primermix лимонска киселина 4µl Прволиниска пуфе 1µl 0,1M DTT 1µl SuperScriptIII RT (200U/μl) 5µl SYBR-Mix 3µlH 2 O dest . 0,03 μl почетен прајмер (100 pmol) 0,03 μl повратен прајмер (100 pmol) и 1 μl H 2 O дист. 1,05g монохидрат лимонска киселина 50 ml H 2 O комплети RNeasy Mini Kit Qiagen GmbH, Хилден вклучува: Прволиниски-баферски RDD (без RNase пуфер) RNeffys лиза за пуфер RLT Rnase-free DNase RW1 RPE уреди 7500 Брзо реално време PCR систем со Софтвер: Верзија за откривање на секвенца 1.5 KC4 Анализа на податоци Софтвер Аналитичка рамнотежа Applied Biosystems, Darmstadt BioTek, Bad Friedrichshall Sartorius AG, Göttingen 15
37 3 резултати од контролната диета едвај се намалија (86,9 ± 24 µg/g во групата сиромашна со железо, 105,2 ± 22,6 μg/g во контролната група. Види слика 6). Концентрацијата на железо во ткивото на црниот дроб од групата богата со железо била 5 пати поголема од онаа на контролната диета (589,4 ± 243 μg/g во групата богата со железо). Слика 5: Хистолошки преглед на црниот дроб на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо. Ткивото на црниот дроб кое било обоено со берлинско сино боење покажува (А) ткиво од глувци кои биле хранети со храна со малку железо, во (Б) со стандардна храна во (Ц) се хранат со храна богата со железо. Кај глувците кои биле хранети со диета богата со железо, може да се забележи значителна акумулација на перипортално железо (стрела). Зголемување: 20 пати концентрација на железо (μg/g) p = 0, EA ST ER Слика 6: Концентрација на железо во ткивото на црниот дроб на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо Концентрација на железо во црниот дроб на глувците по 5 недели ниско железо (ЕА), стандардна ( ST) и 4-недела диета богата со железо (ЕР). Прикажани се средните вредности на најмалку 5 глувци по група. Хепатичен хепцидин израз Хепцидин 1 и хепцидин 2 израз на глувци кои се хранат со сиромашно железо е значително намален во споредба со контролната диета (хепцидин 1: p = 0,001; хецидин 2: 27
40 3 Резултати 400 Концентрација на железо (μg/g) p = 0, p = 0,03 0 EA ST ER Слика 9: Концентрација на железо во ткивото на слезината на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо Концентрација на железо во слезината на глувците по 5 недели ниско железо (ЕА), стандардна (СТ) и 4-недела диета богата со железо (ЕР). Прикажани се средните вредности на најмалку 5 глувци по група. AB 6 5 Хепцидин 1 израз во однос на ß-актин p = 0,03 p = 0,05 Хепцидин 2 израз во однос на act-актин EA ST ER 0 EA ST ER Слика 10: Хепцидин марна експресија кај слезината кај глувци со ниски нивоа на железо, Стандардна и диета богата со железо (А) Хепцидин 1 и (Б) Хепцидин 2 во однос на експресијата на β-актин кај слезината кај глувците следејќи диета сиромашна со железо (ЕА), стандардна диета (СТ) и диета богата со железо (ЕР) измерена со РТ -ПЦР. Резултатите се пријавени како средство за најмалку 5 глувци по група ± стандардно отстапување. Вредностите се релативни вредности кои се нормализирани во однос на контролата (= 1). 30-ти
42 3 Резултати A B C Слика 12: Хистолошки преглед на стомачно ткиво на глувци со ниско железо, стандардна и богата со железо диета со берлинска сина боја на корпус кај глувци (A) по хранење со малку железо, (B) контролна група, (C) група богата со железо. Примерни акумулации на железо во главните клетки на контролната диета и исхраната богата со железо се обележани со стрела. Зголемување: 20 пати. Извршена е анализа на размачкана tern и квантитативна RT-PCR. При анализа на протеини, антителата против STAT3 и активната форма на STAT3, pstat3, покажаа опсег од 70kDa (види слика 15). Сепак, поради постојаниот интензитет на опсегот, истрагата не откри докази за зголемено производство на STAT3. Покрај тоа, изразот IL-6 е измерен со употреба на квантитативна RT-PCR. Поради екстремно ниските нивоа на изразување, се покажа дека нема воспаление (2,3 ± 1,6 во групата сиромашна со железо, 1 ± 0,5 во контролната група, 2,4 во групата богата со железо, види слика 16). 32
43 3 Резултати 600 концентрација на железо (μg/g) p = 0,007 0 EA ST ER Слика 13: Промена на концентрацијата на железо во корпусот на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо Концентрација на железо во корпусот на глувци по 5 недели ниско железо (ЕА), стандард - (СТ) и 4-недела диета богата со железо (ЕР). Глувците дадени вообичаена храна служеле како контроли. Прикажани се средните вредности на најмалку 5 глувци по група. АБ 20 1,5 Хепцидин 1 израз во однос на ß-актин p = 0,03 Хепцидин 2 израз во однос на ß-актин 1 0,5 p = 0,04 0 EA ST ER 0 EA ST ER Слика 14: израз на мрна Корпус на глувци што следат диета со малку железо, стандард и богата со железо (А) Хепцидин 1 и (Б) Хепцидин 2 во однос на експресијата на β-актин во корпусот кај глувците по диета со малку железо (ЕА), стандардна диета (СТ) и диета со висока содржина на железо (ЕР) квантифициран со RT-PCR. Резултатите се пријавени како средства ± стандардно отстапување. Вредностите се релативни вредности кои се нормализирани во однос на контролата (= 1). 33
44 3 Резултати за стандард со малку железо со висока содржина на железо PosKont pstat3 STAT3 tub-тубулин Слика 15: Протеинско изразување на STAT3/pSTAT3 кај глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо анализа на размачкано ткиво на глувците по диета со малку железо, стандардна и богата со железо. Антитела: pstat3 (фосфозигнални трансдуцери и активатор на транскрипција-протеин), STAT3 (сигнал трансдуцери и активатор на транскрипција-протеин). Црниот дроб PosKont одговара на позитивната контрола на црниот дроб. β-тубулин се користеше како контрола на оптеретување. Експресија на 5 IL-6 во однос на act-актин p = 0,01 0 EA ST ER Слика 16: изразување на мрна во корпус на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо Интерлеукин-6 (IL-6) израз во однос на β-актин Изразување во корпусот кај глувците по диета со малку железо (ЕА), стандардна диета (СТ) и диета со висока содржина на железо (ЕР) квантифицирана со RT-PCR. Резултатите се пријавени како средство за најмалку 5 глувци по група ± стандардно отстапување. Вредностите се релативни вредности кои се нормализирани во однос на контролата (= 1). 34
46 3 Резултати 25 Концентрација на железо [! G/g] EA ST ER Слика 18: Концентрација на железо во панкреасот на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо Концентрација на железо во панкреасот на глувци по 5 недели ниско железо (EA), стандард (ST) и 4-недела диета богата со железо (ЕР). Глувците дадени вообичаена храна служеле како контроли. Прикажани се средните вредности на најмалку 5 глувци по група. AB 2 2 Хепцидин 1 израз во однос на ß-актин 1 Хепцидин 2 израз во однос на ß-актин 1 p = 0,03 0 EA ST ER 0 EA ST ER Слика 19: израз на панкреатична мрна кај глувци сиромашни со железо, стандардни и богати со железо Исхрана (А) Хепцидин 1 и (Б) Хепцидин2 во однос на експресијата на β-актин во панкреасот кај глувци следејќи диета со сиромашно железо (ЕА), стандардна диета (СТ) и диета богата со железо (ЕР), квантификувана со RT-PCR. Резултатите се пријавени како средство за најмалку 5 глувци по група ± стандардно отстапување. Вредностите се релативни вредности кои се нормализирани во однос на контролата (= 1). 36
48 3 Резултати 300 Концентрација на железо [! G/g] EA ST ER Слика 21: Концентрација на железо во бубрезите на глувци по диета со малку железо, стандардна и богата со железо Концентрација на железо во бубрезите на глувци по 5 недели ниско железо (ЕА), стандардна (ST ) и 4-недела диета богата со железо (ЕР). Глувците дадени вообичаена храна служеле како контроли. Прикажани се средните вредности на најмалку 5 глувци по група. Израз на АБ Хепцидин 1 во однос на expression-актин Хепцидин 2 израз релативно ß-актин ЕА СТ ЕР 0 ЕА СТ ЕР Слика 22: Хепцидин мрна изрази на бубрези кај глувци следејќи ја сиромашно железо, стандардна и богата со железо диета (А) Хепцидин 1 и (Б) ) Експресија на хепцидин 2 во однос на експресијата на β-актин кај бубрезите кај глувци следејќи диета со сиромашно железо (ЕА), стандардна диета (СТ) и диета богата со железо (ЕР), квантификувана со RT-PCR. Резултатите се пријавени како средство за најмалку 5 глувци по група ± стандардно отстапување. Вредностите се релативни вредности кои се нормализирани во однос на контролата (= 1). 38
50 3 резултати 400 концентрација на железо [! G/g] p = 0, EA ST ER Слика 24: Концентрација на железо во дуоденумот кај глувци по слабо железо, стандардна и богата со железо диета Концентрација на железо во дуоденумот на глувци по 5 недели ниско железо (ЕА), стандард (СТ) и 4-недела диета богата со железо (ЕР). Глувците со стандардна храна се служеле како контроли. Прикажани се средните вредности на најмалку 5 глувци по група. Експресија на Хепцидин 1 во однос на act-актин Експресија на Хепцидин 2 во однос на act-актин 1 0 EA ST ER 0 EA ST ER Слика 25: Изразување на хепцидин мрна во дванаесетпалечното црево кај глувци по диета сиромашна со железо, стандардна и богата со железо (A) Изразување на хепцидин 1 и (Б) хепцидин2 во однос на експресијата на β-актин во дуоденумот кај глувци по диета со сиромашно железо (ЕА), стандардна диета (СТ) и диета богата со железо (ЕР), квантификувана со RT-PCR. Резултатите се пријавени како средство за најмалку 5 глувци по група ± стандардно отстапување. Вредностите се релативни вредности кои се нормализирани во однос на контролата (= 1). 40
51 3 Резултати Ефектот на диетите со малку железо и високо железо врз срцето Не се пронајдени хистолошки промени или акумулации на железо во срцето (види слика 26). Концентрацијата на железо во срцето одговара на 10% од концентрацијата на железо во црниот дроб. Промените помеѓу диетата со малку железо и контролната диета не можат да се видат, но постои тенденција за зголемување на концентрацијата во исхраната со висока содржина на железо (8,5 ± 12,0 μg/g во групата со малку железо, 3,1 ± 5,7 μg/g во контролната група, 25,7 ± 22,9 μg/g во групата богата со железо, видете слика 27). Покрај тоа, нивото на изразување на хепцидин во срцето исто така не покажа промени (Хепцидин 1: 1,5 ± 0,8 во групата сиромашна со железо, 1 ± 0,7 во контролната група, 2,5 ± 1,4 во групата богата со железо; Хепцидин 2: 1,2 3 0,3 во групата сиромашна со железо, 1 ± 0,1 во контролната група, 1,3 ± 0,3 во групата богата со железо). Погледнете Слика 28. ABC Слика 26: Хистолошки преглед на срцето на глувци по сиромашно железо, стандардно и богато со железо диета со берлинско сино боење во срцето на глувци по (А) хранење со малку железо, (Б) стандардно хранење и (Ц) хранење богато со железо . Зголемување: 20 пати. 41