Функционализација на површината на наночестичките за насочена интеракција со биомолекулите - PDF
1 Површинска функционализација на наночестичките за насочена интеракција со биомолекули Дисертација за добивање на академска диплома доктор на природни науки (д-р рер. Нат.) Поднесена во Катедрата за биологија, хемија, фармација на Слободниот универзитет во Берлин, поднесена од Дипл-Хеми. Меике Роскамп од Папенбург јануари 2010 година
2 1-ви рецензент: проф. Д-р. Сабине Шлехт 2-ри рецензент: проф. Д-р. Спор на Ханс-Улрих Реисиг на
4 Др. Би сакал да му се заблагодарам на Јенс Дернедед за пријатната соработка во истрагата на наночестичките кои се врзуваат за селектин и истрагите за токсичноста на наночестичките. Би сакал да и се заблагодарам на Илона Пап за добрата соработка и нејзината голема подготвеност да помогне. Исто така, би сакал да им се заблагодарам на сите одделенија за услуги на Институтот за хемија и биохемија, особено на д-р. Јохан Спандл за запознавање со IR спектрометарот и Рита Фризе за спроведување на TGA. Би сакал да му се заблагодарам на Мајкл Стасијак за лекторирање на ова дело и за неговата морална поддршка за време на пишувањето. Би сакал да им се заблагодарам на студентите Нели Ривас, Франциска Бухнер, Катера Хазин, Мареике Ноа и Кристина Лудерс за нивната синтетичка поддршка. Би сакал да и се заблагодарам на мојата најдобра пријателка Анет Брунсен за поддршката што секогаш ја даваше и покрај големата оддалеченост и нејзиното позитивно влијание врз моите организациски способности. Им благодарам на моите родители за поддршката, на која секогаш можев да се потпрам. Му благодарам на Фриц Вилхелм Вернике за разубавувањето на ладилникот за рефлукс, малите белешки на моето биро и градските обиколки, за поддршката и неговото трпеливост.
5 Содржина Содржина Содржина 1 Мотивација 7 2 Вовед во работната област Синтеза и карактеризација на наночестички Синтеза на наночестички Карактеризација на наночестички Површинска функционализација на наночестички Реакции на размена на лиганди Реакции на периферијата на лиганд Адсорпција на молекули на обвивката на лиганд Комбинација на повеќе методи за функционализација на површината повеќедимензионални архитекти Токсичност Преглед на опфатената медицинска област Агрегација на наночестички Структура и својства на употребените пептиди Наполнети наночестички како градежни блокови за електростатско уредување Управување и стабилност на наночестичките во тампон-VW05-индуциран аранжман на негативно наелектризирани НП-формирање на фибрили предизвикани од наночестички Наночестички кои се врзуваат со селектин 109 5
6 Содржина Зависност од инхибиција на степенот на сулфација Репродуктивност на вредностите на IC 50 Влијание на структурата на врзувачкиот лиганд Влијание на пептидната врска Влијание на должината на ланецот Влијание на големината на наночестичката Споредба на влијанието на испитаните фактори врз вредноста на IC 50 вредностите на ТЕМ студиите Токсичност на клетките на НМ имобилизација на НМ имобилизација на Полимерни влакна Резиме и изгледи Резиме Експериментален дел Кратенки Растворувачи и реагенси Синтези NP синтези Реакции на размена на лиганди Ковалентна модификација на NP синтезите на лиганди Уреди и методи на мерење што се користат Дијализа гел електрофореза NMR спектрометар IR спектрометар Термогравиметриска анализа (ТГРА) Управувачки електрон Спектрометар Конкурентна анализа на врзување врз основа на SPR Библиографија Додаток 216 6
23 2 Вовед во областа на истражувањето Слика 2.7: Производство на наночестички Au координирани со липаза со помош на хемија на клик [77]. Студија за кинетиката на 1,3-диполарната цикалдиција меѓу азид и алкин на површината на златни НП беше спроведена од Тода и Вилијамс (шема види слика 2.8) [79]. Покрај растворувачот, супституентите на алкинскиот кетон, должината на ланецот на поврзувачот, т.е. Х. поврзувачкиот дел од молекулата, помеѓу азидната група и површината на НП и густината на азидните групи на површината на честичките. Сеопфатна споредба помеѓу реакцијата во раствор и на површината на честички не е извршена, но се чини дека стапките на конверзија се многу слични [80]. Интересно, промената на густината на зафатеноста на функционалните групи на површината на честичките имаше поголемо влијание врз добиениот принос од кој било друг параметар испитан во оваа студија. Слика 2.8: Општа шема за формирање на триазол на златни НП [79]. 23
45 2 Вовед во полето на наночестички со гликоконјугирано злато [153, 157] и наночестички кадмиум сулфид [158] и испитани за нивните антилепливи својства или, во случај на полупроводнички наночестички, за нивната соодветност за означување на клетките. Целта на оваа работна група е подобро да ги разбере интеракциите на јаглени хидрати-јаглени хидрати [159], но исто така и да влијае на процесите на адхезија на клетки-клетки со посредство на јаглени хидрати, како што е воспалителниот процес. Полимерните честички исто така можат да послужат како носители на моно- и лигосахариди. Хаг и сор. покажа во 2008 година дека честичките полиглицерол функционализирани со галактоза се способни да ја инхибираат врската со селектин [160]. Покрај зависноста од степенот на функционализација на честичките, во ова дело се најде и јасно подобрување на обврзувачките својства по сулфација на остатоците од галактоза. Оваа опсервација се совпаѓа со работата на Линхард и сор. набудувања направени за хепарин (види погоре). 45
67 []/(10 3 degcm 2 dmol -1 остаток -1) 3 Резултати и дискусија VW19 RR/nm Слика 3.25: ЦД спектри од 50 μm VW19 и 50 μm RR01 на pH 7,4. Подетален опис на структурите на VW19 и RR01 како функција на концентрацијата и вредноста на ph може да се најде во публикациите на Pagel et al. може да се земе од [182, 183]. Во табелата 3.5 е прикажано пресметаното нето полнење на пептидите како функција од ph вредноста. VW19 е позитивно наполнет под pH 10 и негативно наполнет над него. RR01 е веќе негативно наполнет од приближно Ph 5. Додека VW19 има позитивен нето полнеж во неутрални раствори и на тој начин ќе влезе во атрактивни електростатски интеракции со негативно наелектризирани NP, RR01 има негативен нето полнеж во овој опсег на pH, што укажува на одбивни електростатски интеракции со негативно наелектризирани NP. Спротивното важи за позитивно наелектризирани НП. Со RR01, се појавуваат атрактивни електростатски интеракции во овој опсег на вредности на ph, додека одбивни електростатски интеракции се очекуваат со VW19. Табела 3.5: Нето полнење на пептидите VW19 и RR01 со различна pH вредност [179]. ph вредности нето полнеж VW19 [е/пептид] нето полнеж RR01 [е/пептид]
88 3 Резултати и дискусија Слика 3.43: ТЕМ-слики од координатот на MUDS. Au-NP (d = 6 nm) на pH 9 во 10 mm Tris/HCl тампон (а) без и (b, c и d) со 10 μm VW05. Додека НП без пептид беа изолирани и дистрибуирани релативно рамномерно на мрежата ТЕМ, чиста агрегација на честичките можеше да се види во присуство на 10 μm VW05. Во прилог на агрегатите на НП-пептиди со големина од неколку 100 nm, некои индивидуално лежечки НП исто така можат да се најдат при оваа концентрација и подготовка на пептиди. Во споредба со ТЕМ сликите од прелиминарните тестови (Слика 3.40), структурата на агрегатите се чини дека има одреден редослед на краток опсег на места (види слика 3.43 г), но нема редослед на поделба на честичките и покрај значително подобрената дисперзија на честичките. Сушењето на примерокот за време на подготовката на решетката може да доведе до ефекти на агрегација што не се појавуваат во растворот. Примероците подготвени на овој начин дозволуваат само да се извлечат ограничени заклучоци за состојбата 88 во однос на состојбата на агрегација на компонентите
89 3 Резултати и дискусија во решение. Отстранувањето на растворувачот исто така може да доведе до колапс на нарачаните структури ако, како што е познато од агрегатите на НП-ДНК [104], висок процент на структурата е окупиран од молекулите на растворувачот. Така, степенот на подредување на NP-пептидните агрегати во растворот не мора да одговара на оној на ваквите подготвени TEM слики. Снимките со крио-ТЕМ имаат предност што примерокот не е сушен, туку замрзнат, така што примерокот е во состојба споредлива со растворот во однос на растојанијата помеѓу компонентите присутни за време на мерењето. Крио-ТЕМ-сликите на координацијата MUDS. Au-NP и VW05 на pH 9 се прикажани на слика 3.44 и во суштина ги даваат истите резултати во однос на однесувањето на агрегацијата на НП и нивниот степен на редослед во агрегатите како што е прикажано на слика 3.43. Слика 3.44: Крио-ТЕМ слики од 0,05 μm MUDS координиран. Au-NP (d = 6 nm) на ph 9 и различни зголемувања (a и b) без VW05 и (c и d) со 10 µm VW05. 89
За да може да се работи на резултати и дискусија, затоа е неопходна промена на растворувачот. Обидите да се направи ова веќе не беа можни во рамките на оваа работа. Слика 3.46: ТЕМ-слики од мешавина од 0,05 μm MUDS координирана температура од 80 C Au-NP и 10 μm VW05. Уште едно интересно набудување беше направено при третирање на талогот со ултразвук. Претходно виолетовиот, облачен раствор повторно стана чист и црвен преку третман со ултразвук. Фотографии на суспензија на агрегатите пред и по третманот со ултразвук се прикажани на слика 3.47. По кратко време (приближно 10 мин.) Талогот и виолетовата боја се повлекоа. Сè уште не е разјаснето дали овој процес се должи единствено на механичкото разгорување на агрегатите или на ултразвук предизвикана промена во конформацијата на пептидот. Слика 3.47: Фотографии од мешавина од 0,05 μm MUDS коорд. Au-NP со 10 µm VW05 (а) пред и (б) по приближно 20 секунди третман со ултразвук. 92
94 3 Резултати и дискусија h, 6 h, 20 h max/nm c (sr05)/M Слика 3.49: Максимална апсорпција од 0,05 μm MUDS координиран. Au-NP во зависност од концентрацијата на SR05 на pH 9 (10 mm Tris/HCl тампон) директно по мешање на компонентите и по 6 часа и 20 часа. Имаше атрактивни електростатски интеракции помеѓу позитивно наелектризираниот пептид SR05 и негативно наелектризираните НП, што резултираше во мало зголемување на апсорпцијата во апсорпционите спектри (види слика 3.49 и спектрите во додатокот, Дел 8.1.5) и во мало зголемување на гел-електрофорезата Застој на НП-опсезите со зголемување на концентрацијата на пептид (види слика 3.50). За разлика од тестовите со VW05, сепак, не може да се забележи формирање на врнежи и значителна промена во максималната апсорпција. Слика 3.50: Електрофореза на гел на мешавини на MUDS-координирани Au-NP и SR05 на pH 9, горе лево: агарозен гел изложен на бело светло, долу лево: агарозен гел изложен на 254 nm УВ светлина, десно: табела со коефициенти на мешање на применетите примероци. Позицијата на џебовите е обележана со црвена линија. 94
129 3 Резултати и дискусија NP11 беше функционализиран со енантиомер на амин имобилизиран на NP10 и потоа сулфиран. Вредностите на IC 50 на овие два колоида (види Табела 3.10), и за L и за P селектин, не се разликуваат значително едни од други. Според тоа, енантиомерите имаат идентични својства на врзување во овој пример. Табелата 3.11 ги прикажува вредностите на IC 50 на два понатамошни колоноиди, функционализирани со аминопиран. NP12 и NP13 се разликуваат во присуство на сулфатна група (обележана со сина боја во Табела 3.11). Додека NP12 претставува три сулфатни групи по лиганд, лигандот на NP13 има само две со инаку идентична структура. Табела 3.11: Вредности на IC 50 на сулфирани Au-NP. Дијаметарот на јадрото на Au NP е приближно 6 nm. Вредностите означени со зелена боја се определени со различна серија NP, но се математички прилагодени за оваа табела. Име на инхибитор IC 50 L-селектин IC 50 P-селектин IC 50 E-селектин S3Na S 3Na Au S 9 N H NP попладне 1660 часот Н.И. S3Na S 3Na Au S 9 N H NP попладне 300 часот попладне Н.И. S 3 Na S3Na Au S 9 N H S3Na NP7 80 часот попладне 130 часот попладне Н.И. 129
132 3 Резултати и табела за дискусија 3.13: Вредности на IC50 на сулфати Au NP со лиганди кои носат хидрофобни компоненти. Дијаметарот на јадрото на Au-NP е приближно 6 nm. Ознака на инхибитор IC 50 L - селектин IC 50 P - селектин IC 50 E - селектин S 3Na S 3Na Au S 9 N H NP попладне 130 часот попладне Н.И. С 3 На НП часот попладне 150 часот Н.И. Au S 9 N H S 3Na S3Na Au S 9 N H S 3Na NP7 80 часот попладне 130 часот попладне Н.И. Интересно е што MUDS-координираните Au колоиди (NP18) се исто така способни да го инхибираат врзувањето на L- и P-селектинот. Недостаток на Au-NP-координираните MUDS е нивната слаба стабилност на агрегација при pH-вредности помали од 9. Решенијата на Au-NP-координираните MUDS можат да се произведат само во многу ниски концентрации, но тие можат да се чуваат само за кратко време. За експериментите презентирани овде, беше подготвен 30 номоларен раствор (заснован на концентрацијата на НП) и испитан во рок од 24 часа. Вредностите на IC 50 за координатот на MUDS. Au NP со дијаметар на јадрото од приближно 6 nm се наведени во Табела 3.14. За споредба, овде беа утврдени и вредностите на IC 50 на NP7 и на MUD сулфат-координирани Au NP (NP19) со дијаметар на јадрото од приближно 6 nm. Синтезите на NP18 и NP19 веќе се презентирани во Дел (шема за размена на лиганди, видете слика 3.29). 132
134 3 Резултати и дискусија за НП со цитратните координирани Ау НП, кои исто така презентираат карбоксилатни функции на нивната површина. Додека координацијата на MUDS. Au-NP за L- и P-селектин IC 50 - вредности во пикомоларниот опсег, не може да го инхибираат врзувањето на селектинот во присуство на координатот на цитрат. Може да се набудуваат Au NP. Во прилог на негативно наелектризираната подструктура, затоа мора да се исполнат дополнителни барања за да се постигне добар афинитет за врзување. Не е доволно да се понуди негативно наелектризирана честичка во одреден опсег на големина за врзување. Врзувачко однесување на координатот на цитрат. Au-NP веќе укажува на тоа дека измерените резултати не се должат на неспецифични интеракции помеѓу селектинот и наночестичките. На слика 3.71 се прикажани два понатамошни примери на НП кои не покажаа никаков инхибиторен ефект во анализата за врзување на конкуренцијата. а) б) Au N N Au S H Слика 3.71: а) DMAP координација. Au-NP и б) Pol1-координација. Au NP 9.
21 Дури и со високи концентрации на НП, по инкубација на неврзувачките Ау НП со Л-селектин, релативно врзување е 100% и со тоа не е добиена никаква инхибиција. Како резултат, нема мерливи, неспецифични интеракции помеѓу селектинот и НП. Сумирајќи, се добиени вредностите на IC50 во пикомоларниот опсег за сите полисулфирани НП истражени тука, без оглед на структурата. Структурата на лиганд и особено просторното уредување на групите достапни за врзување за селектин изврши силно влијание врз врзувачките својства на НП. Со посложени структури, исто така, може да се добие селективно врзувачко однесување на L- и P-селектинот. Селективноста на П се случи особено со лиганди кои беа лесно податливи и стерично помалку бараа. Едноставните структури ги инхибираат и двата селектини со слични вредности на IC 50. Сигурно предвидување на 9 Полимерот Pol1 беше синтетизиран од Мари Вајнхард. 134