Хранење со диета со висока содржина на маснотии и анализа на триацилглицериди со висока моќност во Дрософила Меланогастер
Резиме
Ова е протокол за исхрана со многу маснотии што се користи за да се предизвика дебелина кај Дрософила, модел за разбирање на основните молекуларни механизми вклучени во липотоксичноста. Тој исто така нуди анализа на триацилглицерид со голема пропусност за мерење на акумулацијата на маснотии во Дрософила и евентуално други модели (инсекти) под различни диететски, еколошки, генетски или физиолошки услови.
Апстракт
Срцевите заболувања се водечка причина за смрт на луѓето ширум светот. Бројни студии покажаа силни врски помеѓу дебелината и срцевите нарушувања кај луѓето, но потребни се повеќе алатки и истражувања за подобро разјаснување на механизмите. Повеќе од еден век, генетски многу послушниот модел на Дрозофила е клучен во откривањето на клучните гени и молекуларните сигнални патишта за кои се покажа дека се многу зачувани надвор од границите на видовите. Многу биолошки процеси и механизми на болести се функционално зачувани во мува, како што се развој (на пример, план на тело, срце), рак и невродегенеративно заболување. Неодамна, студијата за дебелина и секундарни болести како што се кардиоваскуларни заболувања кај модели организми, одигра многу важна улога во идентификувањето на главните регулатори вклучени во метаболичкиот синдром кај луѓето.
Тука предлагаме да се користи овој модел на организам како ефикасна алатка за предизвикување на дебелина, т.е. т.е. користете прекумерна акумулација на маснотии и развијте ефикасен протокол за следење на содржината на маснотии во форма на акумулација на ТАГ. Покрај многу зачуваниот, но помалку сложен геном, мувата има и краток век на траење за брзи експерименти, во комбинација со економичност. Овој напис обезбедува детален протокол за исхрана со висока содржина на маснотии (HFD) во Дрософила, дебелина и анализа со висок проток на триацилглицерид (TAG) за мерење на поврзаното зголемување на содржината на маснотии, со цел да се предизвика многу репродуктивно и ефикасно за големи количини генетски или хемиски скрининг. Овие протоколи нудат нови можности за ефикасно испитување на регулаторните механизми вклучени во дебелината, како и обезбедување на стандардизирана платформа за истражување за откривање на лекови за брза проценка на ефектите на кандидатите за лекови врз развојот или спречувањето на дебелината, дијабетесот и метаболичките болести.
Вовед
Самиот оброк HFD се состои од стандардна храна за мува надополнета со кокосово масло, главно се состои од заситени маснотии за кои се знае дека се поврзани со метаболички синдром 18. Додека дебелината кај моделите на цицачи, како што се глодарите, може да трае со индукциски месеци 19, 20, нашиот оптимизиран протокол за HFD во Дрософила хранејќи се ефикасно и репродуктивно и ја зголеми содржината на маснотии во организмот за неколку дена 12, 14. Овој протокол, заедно со анализата со голема пропусност ТАГ, овозможува ефикасен масовен скрининг за ефектите на генетските фактори, влијанијата врз животната средина и кандидатите за лекови за откривање на нови модулатори на метаболизмот на липидите. Како резултат, овие протоколи треба да разберат и/или да се борат против човечки болести поврзани со прекумерна тежина и дебелина.
Протоколот за хранење е разноврсен и може да се користи за проучување на метаболичките и функционалните ефекти на која било заситена или незаситена масна киселина. Употребата на анализи со висок проток на TAG не е ограничена на D. melanogaster, но може да се прилагоди на различни организми на мали модели со кутикули или тврди екстрацелуларни матрици (на пр. Други видови Дрософила, Ц. елеганс и други модели без'рбетници) содржина на маснотии да се мери под различни еколошки, генетски и физиолошки услови, во која било фаза на развој, зрелост или фаза на метаболичко заболување. Анализата на ТАГ се заснова на колориметриско мерење на низа ензимски реакции кои ги деградираат ТАГ-овите во слободни масни киселини, глицерол, глицерол-3-фосфат и на крај H2O2, што се прави со 4-аминоантипирин (4-ААП) и 3,5- дихлоро-2-хидроксибензен сулфонат (3,5 DHBS) реагира на производство на производ во црвена боја што се мери со спектрофотометар со 96 бунари.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
1. Протокол за хранење со HFD
Оваа табела ги сумира различните состојки што се користат за да се подготви нашата контрола. Откако ќе се формираат, 10 ml храна се става во ампули, се лади во фрижидер и се чува на 4 ° C за долгорочно чување.
илустрација 1 . Хранење со HFD во Дрософила.
Шемата ги прикажува различните чекори на хранење на мувите на контролна храна (нормална исхрана без додавање на кокосово масло NF) или HFD (со додавање на кокосово масло). Целиот процес трае 10 дена по првата колекција за возрасни. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Кај Д. Меланогастер, како што е случај со други видови, постои сексуален диморфизам помеѓу мажи и жени 22. Познато е дека женките се поголеми, со повеќе маснотии во стомакот, отколку мажите 22. За да ја тестираме ефективноста на нашиот протокол, користевме ТАГ-тестови за да ги утврдиме разликите во содржината на ТАГ помеѓу машки и женски стандардни мушички диви видови (w 1118). Податоците покажуваат дека жените имаат повеќе маснотии во целото тело отколку нивните машки колеги (Слика 2)А, Б.) Податоците исто така покажаа дека анализите се стабилни, без варијации во квантитацијата на TAG со текот на времето (до 50 мин по инкубацијата) и без флуктуации во зависност од големината на биолошкиот примерок (3 или 5 муви).
Потврдено е дека потрошувачката на HFD предизвикува дебелина кај луѓето и глувците 19, 20, 23. За да ја тестираме ефективноста на нашиот протокол за хранење, користевме анализи на TAG со нашата HFD и контролирани хранати муви. Откривме дека потрошувачката на HFD во Дрософила предизвика зголемена содржина на маснотии, која постепено се акумулираше со текот на времето (Слика 3)А-Ц) Друг важен наод е дека само по 18 часа хранење со HFD (слика 3)Ц.), бевме во можност да предизвикаме значително зголемување на содржината на маснотии во овие муви. Овие резултати сугерираат дека овој систем на генетски модел е идеална алатка за забрзано истражување за наоѓање нови регулатори на дебелината предизвикана од HFD.
Слика 2 . Анализи на ТАГ кај машки и женски муви.
Беа собрани мушички стари 2 недели на нормална исхрана, групирани по пол (мажи и жени), измерени и мелени (3 или 5 муви по бунар) за анализа на ТАГ. Анализата на ТАГ е извршена во согласност со процедурите опишани во овој документ. Апсорпцијата на секој примерок од 550 nm беше прочитана во различни временски точки (0 мин., 5 мин., 20 мин. И 50 мин.) За да се утврдат какви било флуктуации во квантификацијата на TAG, прочитана со текот на времето, варијација на содржината на маснотии во различна големина на популација (3 и 5 мува) w 1118 муви и разлики помеѓу машката и женската содржина на ТАГ. Резултатите покажале дека жените имале повеќе маснотии отколку нивните машки колеги (А.-Б.) се акумулира, мерењата на TAG не флуктуираат до 50 мин. по инкубацијата на реакцијата на 37 ° C (А.-Б.) Дури и просечните нивоа на TAG остануваат непроменети помеѓу анализите на TAG со 3 или 5 муви (А.-Б.) Податоците се претставени како средна ± СЕМ статистика: нема значителна разлика. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.
Слика 3 . Влијаат на акумулација на маснотии во HFD.Од: Беа собрани 2-неделни женски муви подигнати на нормално или HFD ниво за 5 дена и беа направени анализи TAG за да се утврди маснотијата. Содржината на TAG беше или пондерирана (А.) или ниво на протеини (Б.) нормализиран. Податоците покажаа дека потрошувачката на HFD доведува до зголемено ниво на маснотии со двата начина на нормализација. C: 2-неделни женски муви на нормална/контролна храна (NF) и 18 часа, 1 ден или 2 дена на HFD се испитуваат за содржината на TAG. Резултатите покажуваат значително и прогресивно зголемување на нивото на TAG од 18 часа на 2 дена изложеност на HFD. Податоците се претставени како средна statistics СЕМ статистика: Студентски тест. * p Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Индукцијата на дебелина кај глувците може да трае 19, 20 месеци. Кај мувите, овој протокол за хранење со HFD овозможува индукција на вишок акумулација на маснотии за неколку дена или помалку, предизвикувајќи зголемување на акумулацијата на маснотии само по 18 часот (види слика 2)) Хранењето со HFD со опишаниот протокол ја зголемува или намалува содржината на глукоза 12, Bmm липаза и PGC-1 експресија 24. Ова е за разлика од возрасната Дрозофила, која предизвика брзо намалување на содржината на маснотии и глукоза 25, 26 и зголемена експресија на Бмм 24. Исто така, ги подигнува нивоата на Bmm или PGC-1 за да се заштити дебелината предизвикана од HFD 14, 24. Додека се користат 30% HFD во овој протокол, летајте со 3%, 7% или 15% дебелина предизвикана од маснотии во режим на доза-зависна диета 12, како што е зголемување на времетраењето на хранењето со HFD (слика 3) Исто така, откривме дека индивидуалните масни киселини се главните компоненти на кокосовото масло, т.е. т.е. 14% хранење со лауринска киселина или 5% миристична киселина, предизвикува значително зголемена акумулација на маснотии 12 .
Забрзаниот метаболен одговор со овие муви на терапија со HFD е во корелација со намален животен век 27, како што е забележано кај цицачи 28, но забележано> 80% од мувите преживуваат во последните 20 дена на HFD 27. Брзата индукција на акумулација на маснотии со посредство на зачувани клеточни и молекуларни процеси метаболизмот на липидите и глукозата е корисна за многу студии за дебелина, како што се: Б. Дијабетична или липотоксична кардиомиопатија 10, 12, 13, 14, 15, 16. Важните сознанија за последиците од метаболичката нерамнотежа и поврзаната срцева дисфункција, најверојатно, ќе овозможат компаративни преведувачки студии кај луѓе.
Протоколот за хранење со HFD е компатибилен за употреба со други видови на Drosophila и модели на инсекти кои споделуваат слични диети со D. melanogasters. Овие протоколи за хранење со HFD можат соодветно да се прилагодат за организми како C. elegans или дури и други инсекти за кои се потребни други „нормални“ медиуми за храна. 30% HFD не е погоден за употреба во експерименти кои бараат високи температури; Сепак, помали концентрации на кокосово масло или индивидуални масни киселини може да бидат соодветни алтернативи 12 .
Дебелината, метаболичкиот синдром и сродните болести се во секој момент највисоки со катастрофални ефекти врз здравјето на луѓето 1, 2. Комбинираниот протокол HFD и анализата со голема пропусност TAG обезбедуваат единствена платформа за користење на модели на организми како што е Дрософила, за брзо предизвикување на дебелина и скринирање на генетски фактори, или за користење природни и синтетички хемиски соединенија за подобро разбирање на метаболичката нерамнотежа. На крајот на краиштата, ова може значително да придонесе за унапредување на научното знаење за развој на нови методи на лекување или лекови за метаболички болести.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.