Идентификација на протеини со активност на киназа - Хуман - Храна - Околина
принцип
Хумана фосфо-МАПК низа и -RTK низа за определување на релативни нивоа на фосфорилација на активирани митогени активирани протеински кинази (MAPK), тирозин кинази (RTK) и други серински/треонински кинази
Меѓу каскадите на интрацелуларната трансдукција на сигналот, киназите на митогенот активиран
Комплет со низи за човечки фосфо-МАПК за откривање на повеќе фосфорилирани кинази во третирани, како и нетретирани клетки.
Семејството на протеини киназа (MAPK) игра централна улога. Семејството MAPK комбинира голем број серински/треонински кинази, како што се ERK-1 (p44MAPK), ERK-2 (p42MAPK), јуни N-терминални кинази и p38-MAPK. Стимулацијата на клетката од страна на пр. Митогени фактори обично доведува до зголемување на активноста на МАП киназата. ЕРК-1 и -2, на пример, потоа се преместуваат во клеточното јадро и ги активираат факторите на транскрипција, што последователно доведува до размножување на клетките или диференцијација на клетките, додека инхибицијата на МАПК ги инхибира овие процеси. Со конститутивна активација на овие кинази, може да се појави неконтролиран раст на клетките, што игра важна улога во тумогенезата. Слично на тоа, зголемената активност на ЕРК е поврзана со зголемен потенцијал на тумор за инвазивност и метастаза.
Овие кинази можат да се активираат од разни лиганди на рецептори, при што е добро карактеризиран рецепторот за тирозин киназа, механизам за активирање на ERK1/2. Рецепторските тирозин кинази (РТК) се важни медијатори на физиолошките клеточни процеси како што се пролиферација, диференцијација, подвижност или регулирање на преживувањето на клетките. RTK вклучува рецептор за епидермалниот фактор на раст (EGF) и рецептор за инсулин. Кога лиганд на рецептор се врзува за специфичното место за врзување на RTK, има промена во конформацијата и последователна димеризација на рецепторот. Ова доведува до трансфосфорилација на двата мономера. Фосфорилираните тирозински остатоци од активираниот рецептор формираат докинг точка за протеините на адаптерот, кои потоа се во состојба да иницираат каскада на протеинска киназа. Овој принцип може да се набудува и со други рецептори тирозин кинази.
Со помош на хуманата фосфо-МАПК низа и хуманата фосфо-РТК низа, може да се измери статусот на фосфорилација на голем број сигнални молекули, како и рецепторната фосфорилација во процесот на пренесување на сигналот. Предноста на овие низи е големиот број снимени MAP кинази и RTK:
Снимено МАПК (21 МАПК):
ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, JNK3, JNK-тава, p38-α, p38-b, p38-g, p38d, RSK1, RSK2, GSK-3a, GSK-3b, Akt1, Akt3, Akt2, Akt тава, MSK1, MSK2, HSP27, p70 S6 киназа
Фатен РТК (42 РТК):
EGFR, ErbB2, -3, -4, FGFR1, -2a, -3, -4, InsulinR, IGF1-R, Axl, Dtk, Mer, HGFR, MSPR, PDGFRa, -ß, SCFR, Flt-3, MCDFR, c-Ret, ROR1, -2, вратоврска-1, -2, TekA, -B, -C, VEGFR1, -2, -3, MuSK, Epha1-7, EphB1-6
Принцип на мерење
Антителата специфични за киназата се забележуваат како дублети на нитроцелулозната мембрана и се инкубираат со подготвениот лизат на клетките, а фосфорилираните кинази се врзуваат за забележаните антитела. За откривање, на секое место се пипетира „коктел“ антитела против 21 специфична киназа, на чиј крај е споен биотин. За секое место, се создава повеќеслоен слој на имобилизирани антитела, киназа и комплекс на антитела-биотин во форма на „молекуларен сендвич“. Вистинската реакција на откривање потоа се одвива со додавање на стрептавидин-ХРП и откривање на хемилуминисценција.
Пробна проценка
Клетките биле третирани со подлогата 15 минути или биле оставени без третман. По подготовката на лизатот на клетката и инкубацијата со антителата, откривањето се врши со помош на хемилуминисценција. Дигитализираните слики потоа се проценуваат густинометриски и интензитетот на пикселот се прикажува графички.
трошоци
Приближно 380 € за 4 примероци за истовремено одредување на 21 МАПК
Приближно 450 € за 4 примероци за истовремено одредување на 42 RTK
Пример за примена (општо)
Регулаторно влијание на состојките на храната врз фосфорилацијата на сигналните протеини или рецептори во контекст на имунолошкиот одговор (Ванг и сор. 2007 и Стефен и сор. 2007), како и влијанието на млечните олигосахариди врз процесите на сигнал-трансдуцери (Кунтц и сор. 2009).