Имуномагнетно одвојување на протоколот специфичен за масно складиште Sca1high масни масни клетки (ASC)

Вовед

Во областа на дебелина и дијабетес, фиброзата и воспалението на ткивата играат клучни улоги во развојот и одржувањето на дијабетес тип 2 3. Неодамна, Токунага и сор. покажаа дека од ингвиналните изолирани високи клетки Sca1 (или поткожно, SQ) и перигонадални (или висцерални, VIS) 10 различни гени потписи и ECM ремоделирање in vitro C57BL6/J масни наслаги. ММП14 (МТ1-ММП), прототипен член на фамилијата на матрична металопротеиназа (ММП) од типот на мембрана, посредува во развојот на бело масно ткиво (ВАТ) преку својата колагенолитичка активност 1.

Примери на експерименти што може да се извршат со клетките со следниот протокол вклучуваат тродимензионална култура, студии за диференцијација, анализи за деградација на колаген и РНК секвенционирање 10,11 изолирани и збогатени. Анализите за деградација треба да се извршат со колаген извлечен од киселина за да се обезбеди зачувување на телопептид 11,12. Следниот протокол ќе ги демонстрира методите за изолирање на васкуларната строма на примарните клетки од разни масни наслаги и нивно збогатување во клетки на адипоцити, кои се прогениторни клетки, со користење на имуномагнетни клетки. Валидноста на сортирањето на клетките може да се процени со цитометрија на проток и преку употреба на Sca1-GFP - глувци што изразуваат GFP во клетки Sca1 +, управувано од промотор Sca1 13.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Етичка изјава: Комитетот за употреба и нега на животни на Универзитетот во Мичиген (UCUCA) ги одобри сите методи и протоколи во согласност со упатството за грижа и употреба на лабораториски животни (Институт за истражување на лабораториски животни, Национален совет за истражување). Глувците се сместени во вивариумот на Универзитетот во Мичиген и имаат слободен пристап до храна и вода и се чуваат на 12 часовен светло/темно циклус.

2. Изолација на поткожни (SQ) масни влошки

  1. Еутанизирајте го глувчето со предозирање со изофлуран и пневмоторакс.
  2. Нежно прскајте глушец со 70% етанол и легнете на грбот. Закапете ги шепите на таблата со пена со 22 G игли.
  3. Направете мал пресек на кожата на стомакот. Држејќи го врвот на засекот со форцепс, земете ги ножиците и одделете ја кожата пред да го одделите перитонеумот.
  4. Откако кожата ќе се оддели од перитонеумот од стомакот до градниот кош, кожата се огледува од перитонеумот кон главата преку странични исеченици на кожата по должината на страната на телото.
  5. Огледало на преостанатата кожа во препоните, држејќи ги маснотиите подалеку од вашето тело и закачете се на плочата со 22 G игли.
  6. Префрлете се на фини ножици и пинцети. Фатете ја ингвиналната масна подлога со форцепс на потекло близу перитонеумот и засечете меѓу кожата и ингвиналните маснотии кон препоните напредувајќи избегнувајќи ја SQ од загадување на кожата.
  7. Поставете ја инсолираната влошка за ингвинални маснотии во назначениот плех од 60 мм.

3. Изолација на масните влошки на Висцерал (ВИС)

  1. На сличен начин на чекор 2.5, исечете го перитонеумот отворено за добро да ги откриете висцералните маснотии.
  2. Поместете го цревото далеку кон градниот кош.
  3. Фатете ја масната подлога ВИС на крајниот крај и нежно повлечете ја нагоре. Дисецирајте ја масната подлога ВИС додека внимателно исклучувате ткиво од епидидимална (или матка, ако се користат женски глувци).
  4. Ставете го во фиоката со етикети и повторете го чекор 3.3 за преостанатата ВИС подлога.

4. Колагеназа варење на масни наслаги

6. Верификација на имуномагнетното одвојување на високите ACS на Sca1 со употреба на проточна цитометрија

  1. Исплакнете ги клетките двапати со HBSS (-Ca, -Mg) и одделете ги клетките користејќи 0,05% трипсин.
  2. Центрифугирајте ги ќелиите на 300 xg за 5 мин. Ресуспендирајте ги клетките во 1 ml медиум за култура и пребројувајте комора за броење.
  3. Добијте> 106 клетки во 1 ml културен медиум и центрифугирајте на 300 g за 5 мин.
  4. Отстранете го супернатантот и повторете го чекорот 6.3 уште два пати.
  5. Клетките со 1 ml 2% козлен серум + 2% BSA и блокираат 30 мин на RT.
  6. Центрифугирајте ги ќелиите на 300 xg за 5 мин.
  7. Отстранете го блокираниот раствор.
  8. Додадете IgG2a Alexa Fluor 647 стаорец (0,25 µg, 1: 400) или анти-Sca1 Alexa Fluor 647 (0,25 µg, 1: 400), во 100 µg. l PBS со 2% козјски серум и 2% BSA + PBS на 4 ° C за 30 мин во мракот.
  9. Додадете 1 ml ладен PBS во клетките. Центрифугирајте 300 xg за 5 мин на 4 ° C.
  10. Отстранете го супернатантот и повторете го чекорот 6.9 уште два пати.
  11. Клетките во 1 ml PBS. Поминете суспензии на клетки преку 100 μl. m Сито од ќелија во подготовка за анализа на проток на цитометрија.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Акумулација на Sca1 висок ASCS од разни влошки за маснотии.

Васкуларните стромални клетки изолирани од маснотиите SQ прикажуваат фибробласта, издолжена форма на клетка, без оглед на нивото на изразување на Sca1 (Слика 1А). Од друга страна, VIS (добиени од EWAT) Sca1 високи и Sca1 ниски клетки покажуваат изразени разлики во нивната форма на клетка. Како SQ (изведени од iWAT) Sca1 високи клетки, VIS (добиени од EWAT) Sca1 високи клетки прикажуваат издолжена форма на клетка слична на фибробласт, додека VIS Sca1 ниските клетки покажуваат епителиоидна форма. Високите клетки на SCA1 изолирани од глувците SCA1-GFP лесно се идентификуваат како GFP-позитивни клетки во ткивна култура (1Б) идентификувани. Кога овие клетки беа проценети со употреба на проток на цитометрија, повеќето од GFP позитивните клетки беа потврдени дека изразуваат Sca1 протеини на површината на клетките, како што е откриено со Ti-Sca1 антитело (1С). Високите клетки Sca1 добиени од ингвинални масни влошки го одржуваат капацитетот на адипоцитите - диференцијацијата се зголемува, додека високите клетки Sca1 добиени од EWAT е потешко да се разликуваат со конвенционалната 10 адипогена мешавина во адипоцитите.

Израз на гените зависни од маснотии и депоата на Sca1 High ASCS (Слика 2).

Анализите на транскриптом широк геном со секвенционирање на РНК покажаа збогатување на гени во врска со протеини и модификатори на вонклеточна матрица (GO: 0,031,012, GO: 0005578) во овие високи ASCS 10. Sca1. Во врска со анализите на PCR во реално време, бевме во можност да ги откриеме различните Изразување на колагенолитички MMPs (MMP-2, MMP8, MMP13, MMP14) помеѓу iWAT- и EWAT-изведен Sca1 за да се демонстрира висок ASCS. Кога се користеа гелови од колаген тип I означени со флуоресценција за да може да се процени перицелуларната активност на деградација, ние ја забележавме значително зголемената активност на ремоделирање на колаген со посредство на VIS Sca1 high ASCS 10.

имуномагнетно
Слика 1: Имуномагнетно одвојување на Murine Sca1 високо ASCS од различни масни наслаги (А) Sca1 висок и Sca1 низок ASCS изолиран од SQ (iWAT) и VIS (EWAT). Скала = 100 μ м. (Б) Sca1-GFP клетки изолирани од iWAT од глувци Sca-GFP. Скала = 100 μ м. (C) Експресијата на површината на клетките на Sca1 во Sca1-GFP-позитивните клетки е оценета со употреба на проточна цитометрија. (Лево) контролирајте го IgG (десно) анти-Sca1 антитела кај стаорци. X-оска, интензитет на GFP. Оска Y, Alexa-Fluor 647. Панел А претходно прикажан во Tokunaga, M. et al., (2014) .ig1large.jpg "target =" _ blank "> Кликнете овде за да видите поголема верзија на оваа бројка.

имуномагнетно
Слика 2:. Маст Депо зависно изразување на колагенолитички MMPs, TIMP и колагени (А) Диференцијална експресија на гени на ECM и модификатори на ECM во Sca1 високо ASCS изолирани од различни масни наслаги. (Б) зголемена активност на деградација на колаген на VIS (добиен од EWAT) Sca1 висок ASCS. Распаѓањето на колагенот е прикажано како исчезнување на флуоресцентни сигнали (стрели и врвови на стрели). Inset е зголемена слика на фокусирано распаѓање на колаген со посредство на единечна ќелија на SQ ASCS. Клетките биле култивирани 72 часа. Податоците прикажани претходно во Tokunaga, M. et al., (2014). Кликнете тука за да видите поголема верзија на оваа бројка.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

Тука ја прикажуваме изолацијата и одделувањето на имуномагнетни клетки на глувци ASCS од разни масни влошки и нивната употреба за ин витро експерименти. Презентираниот метод е ефикасен за брза изолација на голем број Sca1-позитивни ASCS, што е поволно во однос на техничката комплексна и скапа изолација на ASCS 9,14, посредувана од FACS. За разлика од FACS, одвојувањето на имуномагнетните клетки не дозволува употреба на повеќе антигени за идентификување на целната популација на клетките. Како и да е, ако површинскиот антиген е добро карактеризиран, употребата на имуномагнетно одвојување го зголемува бројот на клетки без да се потпира на употребата на уредите FACS 15, кои сè уште не се лесно достапни во малите институти без основни установи за да се анализираат многу биолошки истражувачи .

Додека Sca1 не е пронајден во човечкиот геном, идентификацијата и валидацијата на алтернативните антигени на површината на клетките на матичните клетки на масното ткиво зависно од масното депо, заедно со оваа техника на одвојување на клетките, може да ни помогне да ја дефинираме биологијата на матичните клетки на човечкото масно ткиво.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Откривање

Авторите немаат што да откријат.

Признанија

Ова дело е поддржано од NIH DK095137 (THC). Им благодариме на сегашните и поранешните членови на лабораторијата кои придонесоа за развој и рафинирање на опишаните постапки.