Карактеризација на молекуларните механизми на ин виво УВР протокол катаракта индуцирана (во превод на
Резиме
Катарактата е водечка причина за слепило во светот. Ултравиолетовото зрачење од сонцето (УВ) е главниот фактор на ризик за развој на катаракта. Развиен е животински модел на широко предизвикана од УВР-Б катаракта. Во оваа статија ги опишуваме методите за проучување на развојот на катаракта: изложеност на УВ зрачење, квантитативна РТ-ПЦР и имунохистохемија.
Апстракт
Катарактата е водечка причина за слепило во светот. Светската здравствена организација ја дефинира катарактата како заматување на леќата на окото што го попречува пренесувањето на светлината. Катарактата е мултифакториелна болест која вклучува дијабетес, пушење, ултравиолетово зрачење (УВР), алкохол, јонизирачко зрачење, стероиди и хипертензија. Постојат силни експериментални 2-4 и епидемиолошки докази 5.6 дека УВР предизвикува катаракта. Развивме животински модел за УВР Б предизвикана катаракта и кај анестезирани 7 и кај не-анестезирани животни 8.
Единствениот лек за операција на катаракта е, но овој третман не е достапен за секого. Проценето е дека одложувањето на почетокот на катарактата за 10 години може да ја намали потребата за операција на катаракта за 50% 9. Со цел да се одложи почетокот на катарактата, потребно е да се разберат механизмите за формирање на катаракта и да се користат ефективни стратегии за превенција. Меѓу методите за развој на катарактата, апоптозата игра важна улога во индукцијата на катарактата кај луѓето и животните 10. Неодамна се фокусираме на апоптозата во леќата како механизам за развој на катаракта 8,11,12. Се очекува подобро разбирање на ефектите на УВ зрачењето врз апоптотичката патека ќе обезбеди можности за откривање на нови лекови за спречување на катаракта.
Во оваа статија опишуваме како катарактата може да биде експериментално предизвикана од ин виво изложеност на УВР-Б. Повеќе RT-PCR и имунохистохемија се претставени како алатки за проучување на молекуларните механизми на УВР-Б предизвикана катаракта.
Протокол
А. Изложеност на ултравиолетово зрачење
- 15 мин пред изложување, анестетизирајте го женскиот стаорец Спраге-Доули со мешавина од 90 mg/kg кеталар (кетамин) и 10 mg/kg ромпун (ксилазин) со интраперитонеална инјекција.
- Ставете го животното во прицврстувач за стаорци и повлечете ги лигаментите додека не го имобилизирате стаорецот без да се притисне вирус 13.
- Инстилирајте мидриацил (тропикамид), 10 mg/ml, во обете очи на стаорецот за да предизвика мидријаза.
- Ставете го животното така што едното око да биде поставено наспроти тесен зрак УВР на 300 nm 10 nm 14 со целосна ширина на половина максимум и заштитете го контралатералното око со црна фолија.
- Ставете го стаорецот еднострано на под-прагната доза од 1 kJ/m 2 UVR-B на 300 nm за 15 мин. 15.
4. Имунохистохемиско боење
20 мин).
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Различните извори на варијација во мерењата беа проценети со помош на анализа на варијанса и беше откриено дека со оглед на три мерења по животно, варијансата за мерењата е од 15% од онаа за животните. Така, со оглед на целата анализа на леќата, не е можно да се зголеми точноста. Ортогоналните тестови расчистија статистички значајна разлика за пораката каспаза-3 помеѓу 120 часа латентност наспроти пократки латентни интервали.
Ин виво изложеноста на УВР предизвикува експресија на каспаза-3.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Овој труд опишува методи што овозможуваат проучување на молекуларните настани што се предизвикани од катаракта за време на УВР-Б.
Забележувајќи дека повеќето информации за ин виво УВР-катаракта се добиени од експерименти врз албино стаорци Спраге-Доули стаорци 7, 16, 17, 18, 19, решивме да го вклучиме албино стаорецот Спраге-Доули во тековната студија за употреба. Возраста на стаорците беше стара шест недели. Сексот е избран да биде женски, бидејќи, за разлика од мажите, жените имаат помалку алергенска урина. Покрај тоа, нема разлика во полот во сериозноста на УВР-индуцираната катаракта 20.
Сите животни беа чувани и третирани во согласност со изјавата на АРВО за употреба на животни при истражување на офталмологија и визија. Етичкото одобрение е добиено од Комитетот за етика на животни во Упсала, Протокол број C 29/10. Стаорците се купуваат од комерцијален одгледувач (Таконик, Данска).
Шатор "> Извор на тесен опсег УВР беше избран така што УВР спектрално добро дефиниран. Максималната чувствителност на стаорец леќата УВР-Б е околу 300 nm. Дозата 1 kJ/m 2 е избрана околу прагот доза 15. Времето на изложеност е избрано 15 минути за да се предизвика максимално оштетување на леќата 21. Дозата на изложеност на УВ зрачење-Б и пост-експозицијата може да варира во зависност од експерименталниот дизајн.
Спареното органско око има своја предност во форма на статистика и етика во користењето на животните во истражувањето. Еднострана изложеност на окото може да ја искористи едната страна како изложена, а другата страна како контрола кај животно, така што го намалува бројот на животни за половина во споредба со непарниот орган.
Во овој протокол користевме анестезија како метод на имобилизација на животните. Но, постои и друга алтернатива дека ограничувачот на стаорци 13, што го развивме во нашата лабораторија, може да се користи за имобилизација на неестетизирани животни. Стаорците мора да бидат условени од ограничувачот на стаорци пред УВ изложеност. Овој уред исто така овозможува контролирано повторено изложување кога не се препорачува анестезија поради неговите несакани ефекти. Тука го имаме ограничувачот на стаорци како позиционирање и држач за животни под анестезија.
Средството за стаорци е направено од дрво и е во различни позиции во нашата лабораторија. Ние ја чистиме нашата воздржаност пред секое животно да се постави на него. Елементи од дрво, олуци и дрвени засолништа се користат како збогатување во кафезите со стаорци. Ова збогатување е одобрено од Комитетот за етика на животни во Упсала и Федерацијата на европски здруженија на научни животни во лабораторија (FELASA).
Објективот мора да биде подготвен во BSS за кратко време (5-10 мин). Ова ограничување овозможува леќата да остане чиста и транспарентна.
Времето од 30 мин за водење на леќата во пуферот за лиза RA1 е доволно за да се нарушат капсулата и кортексот на леќата. Јадрото на леќата останува тврдо во рок од 30 минути. Јадрото на леќата или зоната без органели се смета за неактивен дел од леќата како фактор на транскрипција. Затоа, јадрото ќе биде отстрането од примерокот со цел да се зголеми изразот на сигнал-шум-израз на mRNA.
ДНК-специфичниот прајмер користен за контрола на чистотата на РНК (без ДНК) е избран по случаен избор да има p53 прајмери. Може да се избере кој било редовно секодиран код на ДНК, особено животински геном. Двете цели беа анализирани со PCR за 10 животни по интервал на експозиција и за секоја цел, содржината на РНК на каспаза-3 беше утврдена во три независни мерења.
RT-PCR дозволува да се измери mRNA од интерес. Реверзната транскриптаза ја претвора mRNA во комплементарна ДНК, која потоа се засилува со PCR. Мерењата беа квантифицирани со користење на стандардната крива со засилување на сериски разредени примероци на добиената cDNA од меѓупросторот. Предностите на користење на стандардна крива се дека стандардната крива обезбедува сигурен начин за пресметување на несигурноста на концентрацијата и дека стандардната крива обезбедува квантитативни мерења на mRNA од интерес. Алтернативно, релативната содржина на mRNA од интерес може да се процени со директно споредување на бројот на циклуси потребни за да се добие стандардизиран флуоресцентен сигнал со помош на постапката за КТ. Главниот недостаток на кривата на калибрација е тоа што бара употреба на повеќе од методот на геномски производи Ct.
Имунохистохемија беше искористена за проучување на просторната дистрибуција на активната каспаза-3 во епителните клетки на леќите.
Очите веднаш беа замрзнати на -70 ° C за да се запре каква било тековна биохемија. Очите потоа се чуваа на иста температура за зачувување.
Имунохистохемијата е поврзана со два општи проблеми, специфичноста на примарното антитело и неспецифичното врзување на антителото. Антителото треба да се добие од добро контролиран извор, со што се гарантира специфичност. Ако е можно, епитопот што содржи ткиво треба да се обои како позитивна контрола. Да се надмине неспецифичното боење Ако е можно, епитопот треба да се блокира пред боење со специфично антитело, негативна контрола. Понатаму, неспецифичното боење може да се минимизира со оптимална концентрација на антитела и време на реакција. Со боење и на ткиво изложено на УВР и на ткиво не изложено на УВР, можно е да се произведе индуциран УВР епитеп, овде каспаза-3. За да се олесни броењето на клетките кои произведуваат сигнал каспепс-3, дигитално е снимена сликата на микроскопот со флуоресценција. За да се минимизира варијацијата во бучавата во позадина, имаме фиксни поставки за сите микроскопски слики.
Интензитетот на сигналот за позадина на флуоресценција варира во континуирана скала. Затоа, треба да се постави праг за значително боење. Сепак, просечната флуоресценција може да варира просторно во рамките на наб observedудуваниот дел, што го отежнува користењето на апсолутен праг за значителна контаминација. Оттука, обично проценката за специфичното боење се заснова на искусен набудувач, а специфичното боење за апсолутен резултат зависи од мислењето на искусниот набудувач, но ќе биде конзистентно за овој набудувач. Поради оваа причина, беше користен само искусен набудувач. За да се подобри она што е предизвикано од експерименталната променлива изложеност на УВ зрачење во споредба со бучавата, фотографијата на секој дел беше преброена три пати.
Секогаш кога е можно, имунохистохемијата треба да биде потврдена со размачкана гарнитура за да се потврди постоењето на епитепи со очекуваната молекуларна големина.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.