Колекција на здив од деца за протокол за откривање на биомаркери за деца (во превод на германски)

Резиме

Овој протокол опишува едноставен метод за добивање примероци на здив од деца. Накратко, примероците од мешан воздух се преконцентрирани во сорбентните цевки пред анализата на гасна хроматографија-масена спектрометрија. Биомаркерите за здив на заразни и незаразни болести може да се идентификуваат со користење на овој метод за собирање здив.

Апстракт

Вовед

Биомаркерите можат да носат вредни информации за нормални и патолошки биолошки процеси кои можат да придонесат за клинички идентификувана болест. Неодамна, се зголемува интересот за евалуација на испарливите здив како биомаркер за различни состојби на болести, вклучувајќи инфекции, метаболички нарушувања и карцином 1. Издишаниот воздух содржи количини на износливи испарливи органски соединенија (VOC), полу-испарливи органски соединенија и микробиолошки добиен материјал (на пр. Нуклеински киселини од бактерии и вируси). Централната цел на анализата на издишаниот воздух е неинвазивен увид во статусот на болеста и/или влијанијата врз животната средина. Постојат неколку методи за собирање и анализа на издишаниот воздух, во зависност од состојките што ги интересираат. Во моментов не постои стандардизиран метод на истражување на издишаниот воздух што ја отежнува компаративната анализа на резултатите од студиите. Стандардизацијата на постапката за собирање здив е важна бидејќи самата постапка на земање мостри има значително влијание врз резултатите од дишењето низводно.

Во многу студии, се користи земање примерок од здив во доцните дишни патишта 2, 3. Овој избор вклучува отфрлање на првиот дел од издишаниот воздух („мртов простор“) со цел преференцијално зафаќање на воздухот на крајот од циклусот на дишење. Предноста на оваа стратегија е тоа што го минимизира нивото на егзогени VOCs (на пример, еколошки VOCs) додека се збогатува за ендогени, специфични VOC на пациенти. Овој метод спречува поединецот да издише во првите неколку секунди пред да го собере примерокот за здив. Други истражувачи користеле сензор за притисок за активирање на земање примероци во однапред дефинирана фазна секвенца 4, 5. Бидејќи сензорите за притисок бараат сложена технологија, овој алтернативен метод бара наменска и релативно скапа опрема за земање примероци.

Детското земање мостри од здив може да биде особено тешко. Голема загриженост е тоа што малите деца не можат да работат со трупци за доброволно издишување на воздухот „мртов простор“. Поради ова, полесно е да се добие мешан здив на дишните патишта од децата. Сепак, важно ограничување кај мешаните примероци на дишење на дишните патишта е ризикот од контаминација на околината и материјалот. Затоа, изводливоста на детската колекција претставува вознемирувачки интерес во оваа област.

Покрај методите за собирање податоци, задржувањето на примерокот од здив може да влијае и на квалитетот на примерокот. Големата влажност на воздухот издишува и ултра-ниските концентрации (делови на трилион) испарливи органски соединенија ги прават примероците од здивот на здивот особено склони кон проблеми поврзани со меморијата 6, 7. И покрај големиот потенцијал на техники во реално време како реакција на протонска трансфер-масена спектрометрија (PTR-MS), GC-MS останува златен стандард за анализа на примероци од здив. Бидејќи анализата на примероци од здив GC-MS е офлајн техника, таа е во комбинација со методи на пред-концентрација, како што се цевки за термичка десорпција (ТД), екстракција на микро-цврста фаза и уреди за заглавување на игла Примероците за здив мора да се чуваат привремено во полимерни кеси 8 пред претходна концентрација. Полимерните кеси се популарни поради нивната умерена цена, релативно добра издржливост и повторна употреба. Додека торбите можат повторно да се користат, потребно е време и напор за да се обезбеди ефикасно чистење 7, 8. Секоја специфична вреќа исто така бара емпириски утврдени и стандардизирани процедури за контрола на квалитетот, повторна употреба и обновување.

ТД цевките се широко користени за пред-концентрација на здив бидејќи зафаќаат голем број на испарливи материјали и може да се прилагодат. Апсорбирачките материјали што се користат за пакување на ТД цевки можат да примат специфични апликации и специфични целни испарливи материјали од интерес. ТД-цевките значително ја подобруваат студијата за биомаркер за здив, особено во оддалечените пасишта, бидејќи ТД-цевките безбедно складираат испарливи средства за здив најмалку две недели и се лесни за транспорт 3 .

Во обид да се стандардизира детското собирање здив за откривање на биомаркер, опишуваме овде едноставен метод за собирање вдишувања од деца. За да се илустрираат репрезентативните резултати од спроведените протоколи, анонимизирани податоци се презентираат на постојана група на деца (8-17 години) при проценката за безалкохолно заболување на замастен црн дроб (NAFLD). Целосните резултати и анализата на оваа студија ќе бидат пријавени во подоцнежното издание. Притоа, известуваме за подмножество на податоци за да демонстрираме примена на нашиот протокол. Накратко, на децата им е наложено да издишуваат нормално преку писка во полимерна вреќа, како да „дуваат балон“. Процесот се повторува 2-4 пати додека не се соберат 1 L здив. Примерокот потоа се пренесува во ТД цевка и се чува на 5 ° C пред анализата на ГЦ-МС.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

Студијата беше одобрена од Институционалниот одбор за преглед на Медицинскиот факултет на Универзитетот во Вашингтон (# 201709030). Добиена е согласност од родител или законски старател пред запишувањето во студијата. Фотографии на слика 2 репродуцирана со писмена согласност од родителите.

(3) Пренос на здив во цевки за термичка десорпција

Соберете ги примероците на амбиентниот воздух околу пациентот веднаш по извлекувањето здив.
1. Ставете ја вреќата на излезот од пумпата со црево, како во дополнителна слика 5прикажано.
2. Преклопете го стеблото на вреќата на вентилот надолу за да го отворите влезниот состав за земање примероци.
3. Заклучете го отворениот вентил со вртење на незгодниот завртка на страната на приклучокот за влез во насока на стрелките на часовникот.
Вклучете ја пумпата и работи со 100 mL/min 12 мин. Пумпата ќе собере 1.200 mL на амбиентниот воздух.
Откако ќе се собере посакуваниот волумен, олабавете ја незгодната завртка на страната на склопот на влезот свртувајќи ја спротивно од стрелките на часовникот и туркајте го стеблото на вентилот додека не заврши фитингот на влезот.
Заклучете го џебниот вентил со вртење во насока на стрелките на часовникот заоблената завртка од страната на филот за влез затворена.
Исклучете ја торбата од пумпата.
Истите чекори како во делот 3. Единствената разлика е во тоа што се пренесува амбиентниот воздух, испарливите органски соединенија, а не оние од здивот.

ЗАБЕЛЕШКА: Услови за анализа на примероци од здив и воздух се опишани во 9.

Анализирајте ги собраните податоци и идентификувајте ги соединенијата во хроматограмите. Користете типични софтверски програми за да ги пронајдете и воспоставите сите врски направени од инструментот (Слика 3А)) признати. На пр. Функција на деконволуција за идентификување на соединенијата. Филтрирајте ги податоците со фактор на големина на прозорецот за задржување од 80, филтер за висина на масата count100 броеви и филтер за апсолутна површина count500 броеви.
Користете хемиски стандарди за идентитетски соединенија во примероци од здив и воздух. Извлечете ја областа на врв на јонскиот врв од соединенијата од интерес, како што се изопрен и β-пинен (Слика 4)) и споредете ги испарливите нивоа во здивот и воздухот.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Резултати од репрезентацијата

Во нашата студија, примероците на здив собрани од 10 деца (8-17 години) моментално се проценуваа во детската болница Сент Луис. Примероци од здив и амбиентален воздух (n = 10) беа собрани како што е опишано погоре. Примероците беа анализирани со помош на гасна хроматографија, масена спектрометрија за време на летот на квадропол (GC-QToF-MS) и термичка десорпција како што е опишано погоре 9. По отстранувањето на загадувачите на позадината, спроведените протоколи резултираа во просек со 311 испарливи органски соединенија (VOC) во секој од измешаните примероци на издишан воздух. Во просек, значително повеќе VOC се пронајдени во примероците на здив во споредба со контролите на околината/животната средина (311 ± 11,5 наспроти 190 ± 12,6, стр. Сл. 3А) Зголемениот број на VOCs во здив, во споредба со амбиентниот воздух, е јасно означен со репрезентативни вкупни јонски хроматограми (TIC) (Слика 3 б) да се спореди.

Како мерка за успешна контрола на квалитетот на собирање здив, нивоата на два обични здив VOCs (изопрен и β-пинен) во споредба со регулаторите за воздух на Цимер (Слика 4) Изопренот, еден од најзастапните VOCs во здив, обично се наоѓа во делови на милијарда (ppb) нивоа (131 ppb), додека β-пиненот се наоѓа во нивоа на под-ppb (0,59 ppb) 6. Двете соединенија се воспоставуваат при здив на здрави возрасни лица во споредба со ниските нивоа присутни во воздухот во затворените простории, што укажува на нормалното збогатување на физиолошките процеси како примарен извор на овие аналити во здив 6. Во тоа време, изопренот (m/Z 67) беше задржан 2,12 минути и β-пиненот (m/Z 93) беше задржан 14,4 минути. Откриваме дека изобилството на изопрени педијатриски примероци на здив е 10 пати поголемо отколку кај регулаторите за воздух во просторијата (слика 4); средна полнота ± SEM се 4,2x10 5 ± 1,0x10 5 и 3,9x10 4 ± 0,9x10 4 за здив и воздух и p = 0.0003) и β-пинен изложи 3 пати поголема полнота во здив отколку воздух (моја полнота full SEM се 3.0x10 4 ± 1.3x10 4 и 9.1x10 3 ± 1.6x10 3 за здив и воздух, соодветно p = 0.007), потврдува успешно собирање здив. Целосната описна анализа на наодите на Биомаркер Дискавери од оваа студија ќе биде пријавена во идна публикација.

Слика 1: Пример за здив и торба за собирање на издишан воздух заедно. Примерок за здив (со отворен син вентил, т.е. означен со двострана црвена стрелка паралелно со приклучокот) и торба поврзана со црево, здив подготвен за собирање. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 2: Дете што издишува здив во вреќа за собирање здив. (А.) Дете кое држи примерок за здив, издишува и (Б.) нуди примерок за здив во џеб. Courtубезна фотографија. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 3: Издишани испарливи производи од здив. (А.) Број на различни испарливи соединенија во секој примерок од здив од педијатриски пациенти (n = 10) и контроли на амбиентниот воздух (n = 10). Се прикажуваат средствата и стандардните грешки на средната вредност (SEM). (Б.) Вкупен јонски хроматограф (TIC) на репрезентативни примероци од здив кај деца наспроти контрола на воздухот за визуелизација. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Слика 4: Изобилство на две издишани испарувања на воздухот. Изобилство на изопрен и β-пинен во примероци од здив од педијатриски пациенти (n = 10) и регулатори на воздухот Зимер (n = 10). Комплетност квантификувана од јонската база на врв. Се прикажуваат средната вредност и SEM. Кликнете овде за поголема верзија на оваа бројка.

Дополнителна слика 1: примерок за здив. Лево: (А) Пример за дишење заедно: 1) машки адаптер + приклучок (2) двонасочен топчест вентил + 3) Тефлонски машки адаптер. (Б) Картонски писка. (Ц) црево со мал и голем дијаметар. Десно: Пример за здив со приклучок за уста и прицврстени цевки. Кликнете тука за да ја преземете оваа датотека.

Дополнителна слика 2: Различни волумени на здив. Горе има слики од торба за собирање исполнета со различни количини на воздух (1 L, 2 L и 2,5 L), како визуелна претстава за приближните количини на здив што треба да се соберат. Кликнете тука за да ја преземете оваа датотека.

Дополнителна слика 3: Вентил на џебот. Лево: стеблото на вентилот е спуштено (џебниот вентил е отворен). Заклучете го џебниот вентил со вртење во насока на стрелките на часовникот завртканиот палец на страната на филот за влез е затворен. Торбата е подготвена да собере здив. Десно: Стеблото на вентилот е на врвот (затворен џеб на вентилот). Кликнете тука за да ја преземете оваа датотека.

Дополнителна слика 4: Пренос на здив. Лево: Сорбентна цевка (1) прикачена на едниот крај на вреќата со цевки со мал и голем дијаметар, а на другиот крај на пумпата. Десно: Забележете жлебен крај на сорбентната цевка; жлебниот крај треба да биде насочен кон торбата за собирање. Кликнете тука за да ја преземете оваа датотека.

Дополнителна слика 5: Собирање на амбиентен воздух. Лево: Пумпа со два приклучока: влез и излез. Отворот на излезот е вклучен со торба за собирање. Влезот на влезот ќе влезе во амбиентниот воздух и ќе го пренесе во торбата. Десно: Поставен е системот за собирање амбиентен воздух. Кликнете тука за да ја преземете оваа датотека.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Дискусија

И покрај значителниот напредок во истражувањето на здивот во текот на изминатата деценија, стандардизираните процедури за земање примероци и анализа на испарливиот гасен здив остануваат недефинирани 10. Една од главните причини за овој недостаток на стандардизација е разновидноста на методите за собирање податоци за здив кои имаат директно влијание врз добиената хемиска разновидност во кој било даден примерок за издишан воздух. Издишувањето на атем содржи широк спектар на испарливи органски соединенија во многу различни концентрации 6. Затоа, промената на методите на истражување не само што го менува изобилството, туку и различноста на супстанциите што можат да бидат присутни во примерокот.

Земањето примероци на гасови од здивот е изненадувачки комплексно. Додека предметите треба да издишат во устата на колектор или во сад што е тесен на гас пред анализата, земањето примероци од здив мора да ги земе предвид и да земе предвид бројни можни променливи. Во оваа работа, ние демонстрираме специфичен, проверен протокол за гас со здив кај деца. Досега успешно го имплементиравме овој протокол со фебрилни деца на возраст од 4 години, во теренско сценарио во околина ограничена со ресурси (Малави), соларна топлина во нашето истражување на здивот и анализа на цевководи за откривање на биомаркер- 9. Потоа, исто така, ги имплементиравме и проценивме нашите протоколи за собирање примероци на здив од деца под проценка во модерна дополнителна клиника за детски болести во САД. Нашите резултати сугерираат дека за идентификација на детските биомаркери за здив, собирањето мешан воздух е критично бидејќи обезбедува вистинско „отпечаток од здив“ од дадена индивидуа. Покрај тоа, мешаниот издишен здив е исто така наједноставниот вид на здив што може да се постигне затоа што се стекнуваат сите фази на издишаниот воздух (уста и нос) 3.

На терен, а особено кога субјектите се сериозно болни, може да биде тешко да се контролираат вообичаените мешачи како што се диета, телесна температура и/или употреба на парфем или креми со одредена тема. Овие фактори можат да влијаат длабоко на обемот и квалитетот на здивот. Поради оваа причина, препорачуваме истражувачите не само да го снимаат времето на зафаќање на здивот и испораката до сорбентните цевки, туку исто така да земат предвид и други фактори специфични за пациентот, како што се диета (на пример, 24-часовно потсетување на диета), употреба на миење на устата и употреба на лекови, специфично да се проценат ефектите на овие потенцијални мешачи при откривањето на биомаркерите и анализите низводно.

Вдишаните воздушни соединенија влијаат и на составот на издишаниот воздух, што може да претставува предизвик за напорите за откривање на биомаркерот за дишење. Анализата и снимањето на амбиентниот воздух е критична контрола, давајќи им на значајното знаење за потеклото на издишаните испарливи воздух. На пример, испарливи профили на амбиентниот воздух се користат за да се утврди дали одреден здив е испарлив при поголема или помала полнота на здивот од оној на околниот воздух 11. Затоа се смета дека одредено соединение за здив е добиено од внатрешноста на телото (на пример, од ендогено потекло) ако концентрацијата е поголема во здивот отколку во воздухот, додека помалата концентрација во здивот укажува на тоа дека оваа супстанца е добиена од околината (на пр. . егзогено потекло). Споредувањето на испарливото изобилство на здив наспроти воздухот во затворените простории исто така служи како важна позитивна контрола за тоа дали собирањето здив е соодветно. Како и во нашите репрезентативни податоци (Слика 4)) покажа дека испарливото соединение изопрен има ендогено потекло и треба да биде присутно во примероците на здив во концентрации> 10 пати повеќе од околниот воздух 6 .

За откривање на биомаркер, непостојаните профили на луѓе со услови на интерес мора да се споредат со избалансирана здрава контролна личност за да може да се идентификуваат обрасците со употреба на статистички методи како што се машинско учење и повеќе варијатна анализа. Методот за собирање здив опишан овде може да се примени на различни патолошки состојби; единствено барање е детето да волонтира со земање мостри од здив. Бидејќи тестирањето на здивот е неинвазивно, едноставно повторувано, и е еднакво на артериска концентрација на биолошки супстанции, ветува многу голема имплементација при тестирање по нега за клиничка употреба.

Идната работа ќе се фокусира на развој на нови методи за собирање здив кај млади доенчиња и деца (задолжителна претплата. Ве молиме препорачајте JoО Jo на вашиот библиотекар.

Откривање

Авторите не откриваат ништо.

Признанија

Им благодариме на децата и семејствата на детската болница Сент Луис кои учествуваа во оваа студија. Ги препознаваме уникатните напори на г-ѓа Стејси Постма и г-ѓа etенет Соколич за време на збирката здив. Оваа работа е поддржана од Фондацијата за детски болница во Сент Луис.