Локалната пролиферација доведува до акумулација на макрофаги во масното ткиво при дебелина

предмети

апстрактен

Акумулацијата на макрофагите на масното ткиво (АТМ) е значајна карактеристика на хронично воспаление поврзано со дебелината. Исто така е важно во регулирањето на развојот на дебелината. Кај посните животни, има мал број на резидентни АТМ-клетки распределени меѓу адипоцитите што се сметаат за макрофаги М2. Во случај на дебелина, значително зголемените макрофаги се акумулираат во масното ткиво и ја формираат таканаречената „структура слична на круната“ (CLS) околу мртвите адипоцити. 1, 2 Овие макрофаги имаат фенотип М1 и произведуваат разни видови на воспалителни цитокини како што се TNF- & agr; што доведува до ширење на воспаление како резултат на дебелина и развој на метаболички нарушувања како што е отпорност на инсулин. 3, 4, 5

Традиционално, на акумулираните банкомати се гледа како резултат на миграција на периферни моноцити под воспалителни услови. Неодамна, зголемените докази покажаа дека одржувањето на ткивото на макрофагите е веројатно независно од надополнување на циркулирачките моноцити, па дури и независно од претходниците на коскената срцевина. 6 Навистина, различни видови ткивни макрофаги се способни да се обноват и да се размножуваат локално во наивна состојба, како што се клетките на микроглија, 7, 8, Купфер, 9 и Лангерханс. Во акутна инфламаторна состојба, на пример за време на паразитска инфекција, локалното размножување на макрофагите е зголемено и овие макрофаги покажуваат фенотипови на алтернативно активирани макрофаги, процес што е контролиран од Th2 цитокини. 11 Во хронични воспалителни состојби како што се артериосклероза, постои и локално размножување на макрофагите, што придонесува за акумулација на макрофаги во артериските wallsидови. 12 Неодамна беше објавено дека локалното множење на макрофагите може да придонесе за акумулација на дебелина на банкоматите. 13, 14

Резултати

Акумулацијата на банкомати во раните фази на дебелината е поврзана со пролиферацијата на макрофагите

пролиферација

Акумулацијата на макрофагите во масното ткиво е поврзана со инфигурирана пролиферација во раните фази на дебелината. ( а ) Тежини на телото на глувци кои се хранат со ND и HFD (n = 10 глувци во секоја група). Лентите за грешки претставуваат средни вредности ± SEM *** P + банкомати во eAT од глувци на ND или HFD. Скала бар, 100 μm

Раната фаза на генетска дебелина е поврзана со размножување на банкомати

Дебелината е резултат на сложени интеракции меѓу генот и животната средина. Во модел на генетски наследена дебелина, глувци со недостаток на лептин рецептори (глувци на лепроза db/db, најчесто наречени db/db), испитавме не само дебелина поврзана со исхраната, туку и дали ин вирусното размножување на макрофагите на банкомат Вклучена е акумулација. db глувци). Откривме дека акумулацијата на банкомат во масното ткиво (eAT и iAT) на глувци db/db глувци во раната фаза на дебелина (стара 7 недели) драматично се зголемува во споредба со онаа на нивните хетерозиготни легари (2а). Во меѓувреме, макрофагите Ki67 + беа значително зголемени во масното ткиво на глувците db/db на лепра стара 7 недели (2b). Ние исто така извршивме тест за инкорпорирање на EdU и откривме дека во раните фази на генетска дебелина (стари 10 недели), значително повеќе инкорпорирани EdU макрофаги се забележани во масното ткиво на глувци db/db глувци (Слики 2в и г). Процентот на EdU инкорпориран банкомат од глувци со напредна генетска дебелина (стар 30 недели) исто така беше значително поголем од оној на слабите постери. Така, пролиферацијата на макрофагите придонесува за акумулација на банкомат во генетска дебелина.

локалната

локалната

За споредба, понатаму го анализиравме химеричното ниво на еозинофили во масното ткиво. Еозинофилите се друга подгрупа на миелоидни клетки за кои е докажано дека мигрираат од периферната крв во масното ткиво и играат важна улога во одржувањето на хомеостазата на глукозата, 15 кои не се размножуваат кај дебели или посни глувци (Дополнителни слики S1a и b ) . За разлика од банкоматите, очигледни еозинофили добиени од донатори (ЦД45.1 +) беа забележани во масното ткиво на дебели глувци и во раните фази (8-недела HFD) и дебелината во доцна фаза (12-недела HFD) (Слика 3д)). Поради оваа причина, ние потврдивме дека акумулацијата на АТМ е активирана од ширење на макрофагите кај жителите во раната фаза на дебелина и понатаму се промовира со миграција на моноцити во доцната фаза на дебелина.

Исто така, покренавме интересно прашање: дали моќта на размножување на макрофагите е ограничена на домашните банкомати или може да се забележи и кај регрутираните макрофаги? За да го поправиме ова, извршивме тест за инкорпорирање на EdU на химерични глувци кои се хранат со HFD 12 недели. Интересно е тоа што и АДМ-инкорпорираните ЦД45.2 + и ЦД45.1 + -Еду се откриени во масното ткиво (Слика 3е), што укажува на тоа дека макрофагите се размножуваат без оглед на нивното потекло. Така, локалното множење и на резидентни и на регрутирани макрофаги придонесува за акумулација на банкомати.

CCL2 е непотребен за акумулација на макрофаги во раните фази на дебелината

За да го поддржиме заклучокот дека пролиферацијата, а не миграцијата на моноцитите, игра клучна улога во акумулацијата на банкомат во рана дебелина, го анализиравме локалниот израз на CCL2 (MCP-1) во масното ткиво, што е централен хемотерактор за миграција на моноцити е Интересно, при интрацелуларно боење откривме дека CCL2 главно се изразува со ЦД45 - ЦД31 - стромални клетки во масното ткиво, а не со ЦД45 + леукоцити или ЦД31 + ендотелијални клетки. Навистина, во ниту една од трите популации на клетки добиени од масно ткиво на дебели глувци, забележан е зголемен CCL2 израз во споредба со оној на слаби глувци (Слика 4а). Следствено, нивото на CCL2 во серумот не беше променето во раните фази на дебелината (Слика 4б). Во подоцнежната фаза на дебелина (HFD> 12 недели), сепак, се најде значително повисоко ниво на CCL2 во серумот (Слика 4в). Овие резултати покажуваат дека CCL2-индуцираната миноцитна миграција не е одредувачки фактор за акумулација на банкомат во раната фаза на дебелина, додека може да ја регулира акумулацијата на банкомат во релативно подоцнежна фаза на дебелина.

пролиферација

пролиферација

Размножувачките банкомати се наоѓаат во CLS. ( а ) Имунофлуоресценција која покажува локализација на банкомати Ki67 + кај дебели глувци предизвикани од HFD. Стрелките на стрелките ги обележуваат банкоматите надвор од CLS. Скала бар, 100 μm. ( б ) Процент на банкомати Ki67 + во CLS и надвор од CLS, каде 225 банкомати биле комбинирани од 7 слики на имунофлуоресценција. *** P + банкоматите постепено се намалуваа заедно со прогресијата на дебелината. Детална анализа покажа дека изразот на RELM- & agr; во банкоматите Ki67 + - во споредба со банкоматите Ki67 - е многу помал (дополнителна слика S2). TNF-? + Банкоматите прво беа зголемени, а потоа се намалија со напредувањето на дебелината. Процентот на Ki67 + TNF- & agr; + Банкомат е споредлив со оној на Ki67 - TNF- & agr; + Банкомати (дополнителна слика С3).

Сигнализацијата IL-4/STAT6 е главниот двигател зад ширењето на банкоматите

Ние понатаму ги испитавме митогените стимули за размножување на АТМ. Се покажа дека IL-4, 11 M-CSF, 12 и CCL2 13 можат да ја контролираат локалната пролиферација на макрофагите. Меѓутоа, кога ги испитавме ефектите на овие цитокини врз пролиферацијата на АТМ, откривме дека само администрацијата на IL-4 може да ја зголеми пролиферацијата на АТМ кај слабите глувци. 19 Кога IL-4 се инјектираше интраперитонеално во слаби глувци, беше забележано драматично зголемување на банкоматите Ki67 + (Слика 6а). Откако ќе се поврзе со неговиот рецептор, IL-4 ги активира JAK1 и JAK3 и потоа доведува до фосфорилација на STAT6, централен фактор на транскрипција за биолошки реакции со посредство на IL-4. 20 Откривме дека пролиферацијата на банкомати предизвикана од IL-4 кај глувци со недостаток на STAT6 е сериозно нарушена (слика 6а), што укажува на критична улога на сигнализацијата на IL-4/STAT6 во банкомат управуван од IL-4 - Укажува на пролиферација. Уште поважно, кај глувците со HFD, процентот на Ki67 + банкомати кај глувци со недостаток на STAT6 беше значително помал отколку кај WT глувците (6b). Така, сигнализацијата IL-4/STAT6 е двигател на пролиферацијата на банкоматите во дебелината.

пролиферација

IL-4/STAT6 го движи ширењето на банкомати. ( а ) Ki67 израз во банкомати од eAT на WT и STAT6 -/- глувци, кои биле изложени на комплекс на антитела на IL-4 и IL-4 (за да се продолжи биорасположивоста на IL-4 in vivo) или PBS за 48 часа биле третирани. ( б ) Ki67 израз на WT и STAT6 -/- глувци на HFD во банкомати (n = 10 во секоја група). Прикажани се средните вредности ± SEM

дискусија

Дебелината е поврзана со акумулација на банкомати кои шират хронично воспаление и промовираат отпорност на инсулин. Претходните извештаи покажаа дека миграцијата на моноцитите во крвта придонесува за инфилтрација на макрофагите во воспалените места. 1, 16, 21 Неодамнешните докази сугерираат дека локалното ширење, исто така, игра улога во регулирањето на акумулацијата на банкомати кај дебелите луѓе. 13, 14 Сепак, соодветните придонеси на овие два настана во акумулацијата на банкомат за време на прогресијата на дебелината не беа решени. Во оваа студија покажавме дека ин вирусното ширење на резидентни макрофаги ја одредува акумулацијата на АТМ во раната фаза на дебелина, додека имигрантските моноцити придонесуваат за акумулација на АТМ во релативно доцна фаза на дебелина. Покрај тоа, и резидентните и регрутираните макрофаги се размножуваат во масното ткиво на дебели глувци (сумирано во 7).

локалната

Шематски приказ на придонесот на пролиферацијата на макрофагите и регрутирањето на моноцити во акумулацијата на АТМ во дебелината. Кај слабите глувци, жителите на макрофагите се во мирување на масното ткиво и одржуваат основно ниво на клеточност преку само-обновување. Во раните фази на дебелината, овие резидентни макрофаги се размножуваат и доведуваат до акумулација на банкомат која е контролирана од дразби што ги емитираат адипоцитите и/или другите имунолошки клетки. Во доцната фаза на дебелина, акумулацијата на АТМ дополнително се зголемува со макрофаги добиени од моноцити, кои исто така имаат способност да се размножуваат. Овие размножувачки макрофаги секогаш се локализираат во CLS и ги опкружуваат апоптотичните адипоцити. Црвените јадра укажуваат на тоа дека макрофагите се размножуваат

Претходно беше објавено дека инфилтрацијата на периферните моноцити игра важна улога во акумулацијата на дебелина на банкоматите. 1 Како една од главните хемокини при посредување при регрутирање на моноцити, се претпоставува дека CCL2 (MCP-1) посредува во акумулацијата на АТМ во дебелината. 16 Сепак, друг извештај покажува дека во отсуство на CCL2, не е забележано намалување на акумулацијата на макрофагите во масното ткиво. 22 Овие контроверзни резултати сугерираат дека миграцијата на моноцитите не е единствениот начин да се регулира акумулацијата на макрофагите во масното ткиво за време на развојот на дебелината.

Нашите резултати покажуваат дека жителите на макрофагите се акумулираат во масното ткиво на глувците во фазите на чиста и рана дебелина. Анализата на фенотипот на банкомати за време на прогресијата на дебелината откри дека значителен број на алтернативно активирани макрофаги се присутни во фазите на чиста и рана дебелина. Сепак, во доцната фаза на дебелина, овој вид на макрофаг е драматично намален. Интересно, пријавено е дека алтернативно активираните макрофаги го зголемуваат капацитетот на липидниот катаболизам. 24, 25, 26 Затоа, алтернативно активираните макрофаги во раните фази на дебелината се главните жители на населението во макрофагите со поспецијализиран липиден катаболизам отколку кај имигрантските макрофаги.

Сумирајќи, можевме да утврдиме дека акумулацијата на макрофагите во масното ткиво за време на дебелината е активирана од ин-сити пролиферација на резидентни банкомати и понатаму се промовира со заедничко активирање на миграцијата на моноцитите и размножувањето на макрофагите. Нашите набудувања даваат увид во еволуцијата на воспалението поврзано со дебелината и може да послужат како водич за развој на терапевтски стратегии за нарушувања поврзани со дебелина.

материјали и методи

Тестирање на животни

C57BL/6 глувци се купени од Лабораторискиот центар за животни во Шангај на Кинеската академија на науките (Шангај, Кина). ЦД45.1 глувците во позадина C57BL/6 беа kindубезно обезбедени од д-р. Јанијун hangанг од Институтот за здравствени науки на Кинеската академија на науките. Хетерозиготни глувци со недостаток на лептин рецептори (Lepr db/+) во позадина C57BL/6 се купени од Центарот за истражување животни на Универзитетот во Нанџинг (Нанџинг, Кина) и се одгледуваат во нашата лабораторија. Глувците STAT6 -/- (C.129S2-Stat6 tm1Gru/J) беа од лабораторијата Jексон (Бар Харбор, МЕ, САД). Сите експерименти беа одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни на Институтот за здравствени науки на Шангајскиот институт за биолошки науки на Кинеската академија на науките.

Дебелината предизвикана од исхраната беше спроведена со хранење на глувци стари 5 недели со HFD што содржи 60 kcal% маснотии (D12492, Research Diets, Newу Брансвик, NJујорк, САД). Контролната група се храни со НД. Тестот за инкорпорирање EdU беше извршен со комплетите за тестирање Click-iT EdU (Life Technologies, Карлсбад, Калифорнија, САД) според упатствата на производителот. На глувците им биле дадени 10 μm 3 часа пред жртвата. g EdU/g телесна тежина инјектирана IP. Реакцијата Клик-АјТ беше спроведена на масното ткиво и се анализираше со проточна цитометрија и имунохистологија. За да се утврди придонесот на резидентните макрофаги во акумулацијата на банкомати, долниот дел на стомакот на анестезирани ЦД45,2 глувци беше заштитен со блок од олово со дебелина од 6 см. На овие глувци им била дадена доза на зрачење од 9,5 Gy & ggr; изложени и инјектирани iv со 10 7 CD45.1 клетки на коскена срцевина. Химеричните глувци биле оставени на реконституција 7 недели пред третманот со диета. За да се испита улогата на IL-4 во пролиферацијата на банкомат, на секој глушец му била дадена комбинација од 5 µg. g IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, САД) и 25 µg. g IL-4 антитела (клон 11Б11, Харлан) инјектирани ip биопродукти за Science, Индијанаполис, ИН, САД) или анализа на PBS и ATM се извршени 48 часа подоцна.

Цитометрија на проток

EAT и iAT беа собрани од жртвувани глувци, исечени на мали парчиња и исплакнат со PBS 1,5 часа со 2 mg/ml колагеназа I (Сигма-Олдрич, Сент Луис, М.С.) 1,5 часа. Пловечките адипоцити се разделија со центрифугирање на клеточната суспензија на 600 × g за 10 минути. Палетите повторно беа суспендирани, филтрирани низ ситници од 70 μm и се лизнуваа со црвени крвни клетки. Клеточната суспензија беше предикубирана со анти-CD16/CD32 (eBioscience, Сан Диего, Калифорнија, САД) со цел да се блокираат рецепторите на Fc пред боењето на површинската молекула. Интрацелуларното боење беше извршено со употреба на комплети за фиксација и пермебилизација според упатствата на производителот (eBioscience). Моноклонални антитела на стаорец, вклучувајќи F4/80, CD45, CD11b, CD45.1, CD45.2, Ki67 и TNF-α беа од еБискус; ЦД115 и Сиглец-Ф беа од Биолегенд (Сан Диего, Калифорнија, САД).

За интрацелуларно боење на RELM- & agr; и TNF-? 1: 1000 GolgiPlug (BD Biosciences, Сан Хозе, Калифорнија, САД) е додаден на колагеназата за време на варењето на ткивото во банкоматите. По боењето на површинската молекула, интрацелуларното боење беше извршено со употреба на комплет за фиксирање и комплет за пермебилизација според упатствата на производителот (еБиосвет). Беа користени зајак-анти-РЕЛМ-α (Абакем, Кембриџ, М-р, САД) и Алекса Флуор 488 коњугиран коза-анти-зајак коза IgG (Технологии на животот).

Имунохистохемија

Масното ткиво беше исечено на мали парчиња и фиксирано со 4% параформалдехид 24 часа на 4 ° С. Потоа беше извршено целосно боење. Накратко, примероците беа пермеабилизирани со 1% Тритон Х-100, блокирани со 1% БСА и 3% ФБС во PBS, а потоа се инкубираат со соодветни антитела на површинските или основните молекули. Во некои експерименти, адипоцитите биле пребоени со BODIPY 558/568 C12 (инвитроген).

Статистичка анализа

Податоците се презентираат како средно EM СЕМ и значењето е оценето со непарен дво опаш т-тест, освен ако не е поинаку наведено. Погледнавме во банкомат П.