Оптимизирана анализа на протоколот In Vivo и In vitro хепатална стеатоза (Превод на германски)
Вовед
Дебелината е растечки здравствен проблем и во развиените и во земјите во развој. Едно од коегзистирачките услови 1 е пријавено дека најчесто се поврзува со безалкохолен замастен црн дроб (NASH), со преваленца која се движи помеѓу 30 и 100 проценти кај пациенти со NASH. Поради силната корелација помеѓу замастен црн дроб и дебелината, моделите на глувци предизвикани од диети се широко користени за проучување на сложените молекуларни механизми вклучени во развојот на NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Хепатичната стеатоза е најраната фаза на НАФЛД и може да премине во безалкохолен стеатохепатитис (НАСХ), цироза и на крај карцином на црниот дроб 7. Затоа, општата цел на овој метод е да се генерираат животински и клеточни модели на хепатални стеатотски услови и да се обезбедат детални протоколи за ефикасна употреба и точно мерење на липидите. Овие модели и мерења се исто така погодни за проучување на други метаболички нарушувања, како што се отпорност на инсулин и дијабетес тип 2.
Бидејќи дебелината е идентификувана како еден од најголемите фактори на ризик за NAFLD, диета со висока содржина на маснотии, богата со сахароза (HFHS) која имитира диета со многу маснотии во западен стил се користи за да се предизвика дебелина кај глувците. Степенот на стеатоза на црниот дроб потоа може да се процени со употреба на различни методи. Прво, анализата на телесната тежина и составот на телото со употреба на нуклеарна магнетна резонанца (NMR) покажуваат акумулација на липиди за време на хранењето. Масната маса и мускулната маса можат да се измерат на неинвазивен начин и во реално време.
Дополнително, снимање со магнетна резонанца (МРИ) се користи за да се прикаже и на целото тело и на дистрибуцијата на маснотии во црниот дроб. Сигналот од сивата скала од анализата на МНР може да се претвори во читлива псевдо слика во боја, а интензитетот на сивата скала и бојата е полу-квантитабилен. Оваа технологија нуди единствени предности за мерење на акумулацијата на липидите кај живите животни. Второ, хистолошката анализа на црниот дроб е најчестиот метод што се користи за утврдување на хепатална стеатоза. Боење со хематоксилин и еозин (H&E) обезбедува хистолошки податоци како што се морфологија на хепатоцитите и инфилтрација на макрофаги, додека боењето со Oil Red-O ја покажува големината и положбата на липидните капки во хепатоцитите. Трето, анализата на содржината на липиди со употреба на екстракција на хлороформ/метанол е точно и квантитативно мерење на липидите на црниот дроб. Вкупните нивоа на триглицерид и холестерол може да се измерат со употреба на биохемиски методи. Важно е дека анализата на екстракција на липиди и боењето со маслото во црвена боја О исто така се користат во генетски манипулирани или фармацевтски третирани хепатоцити.
Предноста на сегашниот метод е употреба на неколку оптимизирани пристапи за генерирање на хепатални стеатотски модели и сеопфатно карактеризирање на фенотипите и ин виво и ин витро. Моделите на глувци ДИО можат да ја рекапитулираат патологијата и метаболичкиот фенотип на заболување на човечки замастен црн дроб. Другите метаболички параметри кај луѓето може да се реплицираат и во овој модел 8. Генерирање на стеатотичен хепатоцитен модел како одговор на висока гликоза плус инсулин е ефикасно, корисно и го надминува ограничувањето на скапиот и долготраен начин на функционирање на глувчето. Заедно, овие методи се доволни и неопходни за испитување на нарушувања на црниот дроб липиди и инсулинска резистенција во случај на преоптоварување на хранливи материи.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
Сите протоколи за тестирање на животни се одобрени од Комитетот за грижа и употреба на институционални животни при Институтот за исхрана на луѓе, Институтот за биолошки науки во Шангај, Кинеска академија на науките (Шангај, Кина).
2. Примарен модел на хепатоцити на глувчето
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
Како во 1А Како што е прикажано, телесната тежина на глувчето се зголеми на 45 ± 1,2 g по 16 недели хранење со HFHS, што е околу 1,5 пати повисока од групата за снабдување со диета Chow. Дадени се анализи на составот на телото NMR кои покажуваат масна маса и мускулна маса на глувци (1Б). Распределбата на маснотиите на целото тело и црниот дроб беше утврдена со МНР, а репрезентативните псевдо-бои слики кај глувци што живеат во живот се 1С-Д прикажано. Тежината на телото и составот на телото беа измерени и визуелизирани за време на процесот на хранење со диета HFHS.
За да се расчленат стеотичните фенотипови, глувците беа жртвувани и беше извршена хистолошка анализа на црниот дроб. Дамките на црниот дроб од H&E и Oil Red O се во 2А-Б демонстрирано кај липидните капки поголеми и ги зафаќа просторите во повеќето хепатоцити по 4 месеци хранење со диета HFHS. Степенот на хепатална стеатоза на глувци кои се хранат со диета HFHS е лесно визуелизиран со споредување на глувци кои се хранат со диета со Chow. Главните компоненти на липидот, како што се триглицерид и холестерол, беа извлечени со употреба на хлороформ/метанол (2С) мери. Кај глувците ДИО, прекумерното преоптоварување на хранливите материи предизвикува абнормална акумулација на триглицерид во црниот дроб. Со податоци од NMR, MRI и хистолошка анализа, степенот на таложење на липиди ќе се утврди ефикасно и прецизно.
Како во 3 прикажани, нивото на липиди во примарните хепатоцити беа предизвикани од висока гликоза плус инсулин за 24 часа. Акумулираните липидни капки беа означени со боење на масло во црвена боја О. (3А) а квантитативната анализа на липидите беше проследена со нивоа на триглицерид и холестерол во хепатоцитите (3Б) се користи за мерење на утврдени. Врз основа на моделот, ефектите на генетската модификација или фармацевтскиот третман врз липидната хомеостаза кај хепатоцитите може да се изучат на ефикасен и брз начин.
Дискусија
NASH е серија на прогресивни заболувања на црниот дроб поврзани со метаболички синдром, дебелина, инсулинска резистенција или дијабетес мелитус тип 2 (T2DM) 11. Белег на NAFLD е стеатозата, акумулација на липиди во хепатоцитите. Тука, претставен е спектар на методи за карактеризирање на фенотипите и параметрите на црниот дроб стеатоза со помош на глувци DIO и примарни хепатоцити на глувци. Оваа постапка може да помогне во разјаснување на молекуларните механизми на NAFLD и други поврзани метаболички нарушувања.
Анализите на составот на телото, вклучително и НМР и МРИ, даваат неинвазивни и податоци во реално време за липидите во целото тело и црниот дроб. Тоа е неинвазивно, заштедувачко време, визуелизирано и полуквалитетно мерење. Покрај тоа, точноста на анализите на составот на телото може значително да се подобри со комбинирање на други хистолошки и биохемиски мерења. Критично е и потребно е да се утврди хепатална стеатоза in vivo, и in vitro со употреба на дамка H&E, дамка на маслото Red-O и мерење на липидите, сите од нив се златни стандардни мерења за дијагноза и оценување на црниот дроб стеатоза.
Едно од ограничувањата на овој метод е неговата неспособност да се измери воспалението и таложењето на колаген, бидејќи едноставната стеатоза преминува во хепатитис, фиброза и на крајот цироза и карцином на црниот дроб. Бидејќи дебелите глувци предизвикани од диета имаат мал ризик од развој на NASH, сегашниот протокол е доволен за да се процени хепаталната стеатоза кај глувците ДИО. Сепак, под услов на НАШ, треба да се користат други биохемиски мерења, како што се нивоата на плазма аланин аминотрансфераза (ALT) и аспартат аминотрансфераза (AST).
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Откривање
Авторите наведуваат дека немаат финансиски интереси.
Финансирање: Оваа работа беше поддржана од грантови од Националната фондација за природни науки на Кина (бр. 81270930, 31471129 и 31671224) и Програмата за сто таленти на Кинеската академија на науките (2013OHTP04) на YL