Откривање на интеракции на протеините и карактеризирање на функцијата на протеините со употреба на технологија HaloTag

Резиме

Технологијата HaloTag е мултифункционална технологија која покажа значителен успех во изолацијата на малите и големите протеински комплекси од клетките на цицачите. Тука ги потенцираме предностите на оваа технологија во споредба со постојните алтернативи и ја покажуваме неговата корисност да се проучат бројни аспекти на функцијата на протеините во еукариотските клетки.

Апстракт

Вовед

Разбирањето на клеточната функција, одговорот на дразбите и промените во развојните и/или состојбите на болеста е тесно поврзано со де-преклопување на протеомот во овие различни динамички состојби 1,2. Многу е направено за да се разбере протеомот на долните организми, но со оглед на бројот на протеини и сите можни интеракции, ова стана многу предизвикувачко во справувањето со хуманиот протеом 1, 3-7. Напредокот во масената спектрометрија во голема мера ја овозможи можноста за спроведување на овие студии, и тука претставуваме дополнителен и значаен напредок во развојот на технологијата HaloTag и за ефикасно откривање на протеински комплекси и за функционално карактеризирање на човечки протеини од клетки на цицачи 8-10. Оваа технологија неодамна се покажа во неколку студии дека е критичен фактор за откривање на важни интеракции, овозможувајќи увид во новата функција на протеините и разбирање на болеста 11-13.

Тука ги презентираме протоколите за пулдаун и слики применети на два клучни терапевтски протеини, протеинскиот бромодомен BRD4 и хистонска деацетилаза, HDAC1 17. Со овие примери, ја покажавме интеракцијата со партнерите како што се очекува со масена спектрометрија, ензимска активност по комплексна изолација за HDAC1 и правилна клеточна локализација за обајцата. Заедно, овие резултати ја демонстрираат мултифункционалната природа и силата на техниката за карактеризирање на еукариотски протеински интеракции и функција.

Протокол

Забелешка: Следниот протокол може да се користи со која било HaloTag Fusion и во која било избор на клеточна линија стабилно или привремено трансфектирано. За овие примери, ние обезбедуваме протоколи за минливо трансфекција на фузии на HaloTag во ќелии HEK293T или HeLa. За сите експерименти, препорачуваме да користите само контролен протеин.

1. Тест за експресија на протеини во фузија

3. Клеточна слика на флуоресцентно обележани фузиони протеини со употреба на цитоплазматски и нуклеарно пропустлив лиганд

  1. Трансфекција, назначување и ќелии на слика:
    1. Во 8-бунарни коморни навлаки за секој фузивен протеин или контрол, плоча 400 μl на HeLa клетки во соодветниот медиум во секоја бунар со густина од 1-2 x 10 5 клетки/ml.
    2. Инкубирајте 18-24 часа на 37 ° C и 5% CO 2, а потоа трансфектирајте како што е препорачано.
    3. 18-24 часа по трансфекцијата, разредете го TMR Ligand 1: 200 во соодветни клетки, а потоа додадете 100 μl од овој раствор на секој бунар и нежно измешајте.
    4. Инкубирајте ги трансфектираните клетки што содржат лиганди 15 минути на 37 ° C и 5% CO 2.
    5. Аспирирајте ги лигандите на медиумите и заменете ги со 500 μl соодветни медиуми што содржат лиганди што недостасуваат протеинска фузија, загреани на 37 ° C
    6. Повторете двапати за вкупно три миења.
    7. Ставете ги клетките повторно во инкубатор (376, C и 5% CO 2) за 30 мин.
    8. Аспирирајте медиуми и заменете ги со 500 μl соодветни медиуми што се загреани на 37 ° C
    9. Слика на микроскоп со соодветни параметри на стекнување (побудување на TMR: 555 nm, емисија: 585 nm).

Резултати од репрезентацијата

Кога работите со кој било нов фузиен протеин, важно е прво да се испита изразот на протеинот по трансфекцијата, а исто така да се потврди дека се произведува протеин со точна молекуларна тежина. Бидејќи HaloTag фузионите протеини можат да бидат флуоресцентно и ковалентно обележани со пропустливи или, во зависност од локализацијата, непропустливи лиганди, можно е брзо да се одреди изразот со денатурирање на лисати на клетките со електроефереза ​​на гел, проследено со скенирање на флуориматорот. Користејќи го во делот 1.2, отпечатете ги Halo BRD4 (189 kD) и контролираните HaloTag сам (Ctrl) забележани (34 kD), 2А) опишан протокол. Како што споменавме во протоколот, експресијата на фузиони протеини може да се открие и со конвенционалните размачкани вестерни со анти-ХалоТаг антитела, или ако се присутни, антитела на протеинот на мамката. Ако е можно, се препорачува да се користи флуоресцентен лиганд, бидејќи е попрецизен, побрз и полесен од откривањето на антитела и исто така квантитативни 10.

Изолирани комплекси, исто така, може да се испитаат за активност; Се препорачува елуирање на комплекси со ТЕВ-протеаза (протокол дел 2.5), така што тие ги задржуваат функционалностите. Во Слика 3А Прикажано е сребрено боење на гел Halo-HDAC1 пулдаун комплекси ослободени од смолата со употреба на TEV протеаза. Како ТЕВ-протеаза, значителни количини на мамка протеин, во овој случај HDAC1, се забележуваат во областа на поврзувач помеѓу фузиониот протеин Tag и неговиот партнер за фузија (Слика 3А) да подели. За да се утврди дали оваа фракција има активност на HDAC1, примероците со излупени ТЕВ беа тестирани со анализа на HDAC-луминисцентни HDAC-Glo 21. Како во 3Б Како што е прикажано, примероците од пулдаун HDAC1 покажаа висока активност HDAC1 (колона 1) што беше специјално инхибирано со познат инхибитор на HDAC, SAHA 22 (колона 2). Како контроли за понатамошна демонстрација на специфичност, не е забележана инхибиција на HDAC со поврзан инхибитор на семејството на сиртуин, EX-527 22 (колона 3) и не е откриен сигнал само со тампон даден без HDAC1 пулдаун сонда (колона 4).

Суштински дел од функционалната протеомика и комплексите за разбирање е исто така разбирање на локализацијата на протеините и/или трговијата со луѓе. Бидејќи истите овие конструкции на фузија можат да бидат флуоресцентно обележани во клетките, ние ја следевме нивната локализација користејќи конфокално снимање. Следејќи го протоколот во Дел 3, HeLa клетките станаа минливи со Halo-BRD4 (4А) и Halo-HDAC1 (4Б) трансфектирани флуоресцентно обележани со ТМР лиганд и снимени. Како во 4А и 4Б прикажани локализирани и во јадрото како што се очекуваше 17. Овие податоци покажуваат дека присуството на Tag не ја менува физиолошката клеточна локализација на партнерот во фузија.

интеракции
Слика 1. Шема на апликации на белковини на протеини и конфокални слики. Користејќи го како нервозна конструкција можни се неколку апликации за разбирање на функцијата на протеините во клетките на цицачите. За секого, конструкцијата за фузија на хало е или стабилно или привремено изразена во прилепени или суспендирани клетки на цицачи. За белковини на протеински комплекси, клетките се лизираат, комплекси ковалентно заробени на смола и се елуираат или со елуирање на СДС (лева лента) или расцепување на TEV (десен пат). Елукцијата на СДС се препорачува за вас да продолжите со анализа на масена спектрометрија, додека варењето на TEV е оптимално за извршување на функционална анализа. Со цел да се карактеризираат изразот, клеточната локализација, настаните со трговија со луѓе или прометот на протеини, живите клетки, фузионите протеини флуоресцентно обележани и понатаму анализирани на гелови SDS-PAGE или со помош на конфокална слика. И клеточните или нетранспарентните флуоресцентни лиганди се достапни, во зависност од локацијата или претставата на фузиониот протеин во клетката.

ild 2 "fo: content-width =" 6in "src ="/files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg "width =" 600 "/>Слика 2. Анализа на протеин на Halo-BRD4, повлекување и масовна спектрометрија. (А) Гелови со SDS-PAGE кои покажуваат експресија на Halo-BRD4 фузивен протеин, 189 kD и Halo-tag фузивен протеин сам, 34 kD, контрола (Ctrl) во рамките на лизатот на клетките HEK293T со лиганд на TMR (протокол дел 2.1). Гелите биле скенирани со флуориматор за откривање и бил користен флуоресцентен маркер за молекуларна тежина. (Б) Гелови за боење на сребро исцедени од биолошки репликации за пулсирања од примероци на Halo-BRD4 и Ctrl со SDS. Големини на молекуларна тежина за спектралните броеви на гел (лево) и вредностите на факторите за нормализирана спектрална изобилство (NSAF) (десно), кои отпаѓаат на протеинските молекуларни тежини на протеините идентификувани во анализата на масената спектрометрија на биолошките реплицира Хало. (C) BRD4 и Ctrl. Прикажани се протеини за кои е познато дека комуницираат со BRD4, вклучувајќи ги компонентите pTEFb (CDK9 и циклин Т) 18,20 и BRD9 19. Во Ctrl не биле идентификувани пептиди од овие протеини.

интеракции
Слика 3. Хало-HDAC1 комплексна анализа на изолација и активност. (А) Сребрени гелови за боење кои ја покажуваат изолацијата на Halo-HDAC1 комплексите и позадината од Ctrl по расцепувањето на TEV (Протокол Дел 2.5). Означени се истакнатиот појас HDAC1 (55 kDa) и лентата TEV протеаза. Бесплатниот HDAC1 е оптимизиран со расцепувањето TEV во рамките на поврзувачот помеѓу HaloTag и HDAC1 секвенцата на фузија по вклучувањето на смолата (Илустрација 1). (Б) Графиконот ја прикажува активноста на примероците на изолирани комплексни HDAC1 во анализата на луминисцентната хистанска деацетилаза, генерирана од HDAC Glo 21. Колоната 1 од графиконот покажува високи нивоа на активност на HDAC со примероците на хало-HDAC1, (HDAC1). Колоната 2 покажува дека оваа активност може да се намали специфично со додавање на HDAC инхибитор, SAHA 22, во повлечените примероци HDAC1. Како контроли, колоната 3 покажува инхибитор на деацетилаза специфичен за семејството на сиртуин, но не ги инхибира HDACs, EX-527 22, не ја инхибира активноста на HDAC1 и колоната 4, не се забележува активност со само тампон.

откривање
4. Конфокално снимање на Halo-BRD4 и Halo-HDAC1. Конфокално сликање на живи клетки на HeLa клетките со Halo-BRD4 (А) или Halo-HDAC1 (Б) трансфектирани со ТМР флуоресцентно етикетирани лиганди. (А) Изразот на Halo-BRD4 ограничен на јадрото и (Б) Хало-HDAC1 изрази претежно нуклеарни. Левата страна на панелот со флуоресцентни канали и десно е преклопување на флуоресцентниот канал со каналот за секој DIC. Сликите се стекнати со употреба на конфокален микроскоп опремен со климатска комора од 37 ° C + CO 2 со соодветни комплети филтри. Скала лента = 20 μm.

Дискусија

Штом протеините со фузија се подготвени за експерименти со пулдаун, за да се постигне максимален успех со протоколот, многу е важно да се следат препорачаните временски рамки во делови за лиза, врзување и перење, бидејќи една од најголемите предности е брзината на комплексната изолација Процес. Ако кој било од овие чекори се пролонгира на време, како што е потребно за постапката за откривање базирана на антитела, постои ризик од комплексна дисоцијација или зголемено неспецифично врзување 8. Исто така, ако се скратат времињата за време на клеточна лиза или врзување клетките не се целосно лизирани или заробени ефикасно или заробени. Доколку се намали бројот на миења или не се случи добро мешање на смолата при врзување или миење, тогаш се зголемуваат нивоата на неспецифични протеини во позадина. Покрај тоа, средството за лиза е многу важно бидејќи е поврзано со афинитетот за врзување за смолата. Обиди за сонификација на примероците, отстранување на препорачаниот детергент, додавање на СДС или друг силен детергент и/или кој инхибиторот на протеазата AEBSF ќе го намали или ќе резултира во губење на врзување на фузиони протеини и нивни комплекси со смолата.

Како што споменавме во воведот, значителен напредок во протеомиката е активиран со значителен напредок во масената спектрометрија 1,7. Оттука, важно е да се потенцираат важните параметри за избор на анализа на масена спектрометрија со цел да се распадне растворувањето на мешавината на протеини добиени во пулсирањата. Инструментацијата мора да биде робусна и способна за редовно и ефикасно анализирање на примероци кои содржат мала количина протеини, често помалку од 23,24. Со технологијата HaloTag, може да се користи мултифункционален пристап, промовирање на студии на ProteomICs и добивање на подобро разбирање на функцијата на протеините во клетките на цицачите.

Откривање

Трошоците за објавување на овој напис се спонзорирани од корпорацијата Промега. Данет Л. Даниелс, quаки Мендез, Хелен Бенинк, Ендру Нилс, Ненси Марфи и Марџета Урх се вработени во корпорацијата Промега, сопственици на трговија со доделување патенти за технологијата ХалоТаг и нејзините апликации. Мајкл Форд, Ричард onesонс, Рави Амунугама и Дејвид Ален се вработени во MSBioworks, услугите за масовна спектрометрија опишани во овој ракопис.

Признанија

Му благодариме на д-р. Мартин Розенберг, д-р. Гери Тарпили, и Др. Кит Вуд за поддршката на оваа работа и д-р. Jamesејмс Кали за критичко читање на ракописот. ДЛД, ЈМ, ХБ, НМ, АН, ЈЦ и МУ се вработени во корпорацијата Промега. MF, RJ, RA и DA се вработени во MS Bioworks, LLC.