Пасивација на површината за протокол за проучување на молекули во молекула (превод на германски)

Резиме

Ние опишуваме метод за пасивирање на стаклена површина со употреба на полиетилен гликол (PEG). Овој протокол вклучува чистење на површини, функционализација на површината и обложување на PEG. Воведуваме нова стратегија за третирање на површината со PEG молекули во текот на два круга, што резултира со супериорен квалитет на пасивација во споредба со постојните методи.

Апстракт

Вовед

При изведување на студија за протеини во единечна молекула, важно е да се постигне висок квалитет на пасивација, така што експериментот ќе биде ослободен од каква било површинска индуцирана дефект или денатурација 1,2. Додека стаклена површина со сурфактанти како што се албумин од говедски серум најчесто се користи за студии со единечна молекула на нуклеинска киселина 3, нивото на пасивација не е доволно високо за студии на протеини. Стаклена површина обложена со полимер (полиетилен гликол, PEG) е супериорна во перформансите на пасивација 4-6. Притоа, тој е широко користен за студии на молекули на протеини, откако беше воведен за студија за флуоресценција на молекули 7/10. Полимерното обложување обработува неколку површински третмани 7,11,12. Оттука, тешко е да се следи целата постапка без детални упатства. Честопати, нивото на пасивација на површината варира во зависност од тоа кој протокол се следи. Овде претставуваме робустен протокол со чекор-по-чекор инструкции што ќе го отстранат едно од најголемите тесни грла на студии за единици на молекули на протеини. Ве молиме упатете се илустрација 1 за преглед.

Протокол

1. Подготовка и чистење на слајд

Микрофлуидната комора се состои од кварцен слајд и ливче за покривање. Микроскопија за внатрешна рефлексија (TIRF) слична на призма, се слика површината на слајдот. Оттука, важно е темелно да се исчисти кварцен слајд со раствор на H 2 O, ацетон, KOH и пирана. Чистењето со повеќе чекори ги отстранува флуоресцентните органски молекули на површината што се меша со мерењата на флуоресценцијата на една молекула. Покрај тоа, оревот од пирана ја прави кварцната површина хидрофилна со генерирање хидроксилни групи. Слободните хидроксилни групи се за реакција на амино-силанизација во чекор 3.

Микрофлуидна комора е составена од кварцен слајд и усна на обвивка. Кога се користи микроскоп TIRF од типот на призма, површината на стаклото за покривање не е сликана. Затоа, доволно е да се исчисти ливчето на капакот само со H 2 O и KOH. Во случај да треба да се слика спуштање покривка (на пример, преку микроскопија TIRF од типот на целта), се препорачува да се третираат прекривките со раствор од пирана (чекор 1.7). Имајте на ум дека ако PEGylation на горната површина не е со висок квалитет, тоа може да дејствува како мијалник за протеини и да резултира со флуктуации во концентрацијата на протеини.

  1. Исплакнете со H 2 O. Ставете ги ливчињата на капакот (24 x 30, 24 x 40 или 24 x 50 mm 2) во стаклена кивета. Типично, 5 до 15 ливчиња за покривање се ставаат во еден сад. Исплакнете ги лизгачите на капакот 3 пати со MilliQ H 2 O
  2. Чистење со KOH. Заменете ја водата со 1 M KOH и соникирајте ги лизгачите на капакот 20 минути или подолго.
  3. Исплакнете со H 2 O. Исплакнете ги навлаките за навлаки 3 пати со MilliQ H 2 O за да отстраните траги од KOH. Продолжете со чекор 3.

3. Амино-силанизација на фолии и наочари за покривање

Функционализирање на површината на кварцниот слајд и лизгање на капакот со амин група преку хемијата на амино-силанизација. Метанолот се користи како растворувач и оцетна киселина како катализатор за реакцијата на амино-силанизација.

  1. Исплакнете со метанол. Заменете го MilliQ H 2 O во садовите за боење (од ЧЕКОРИ 1 и 2) со метанол. Држете ги слајдовите и навлаките во метанол до чекор 3.3. Бидејќи нечистотиите во метанол фолиите и капакот се лизгаат во метанол за непотребно долго време (на пр. Неколку часа) се апсорбираат на површината.
  2. Подгответе решение за амино-силанизација.
    1. Исплакнете колба Пирекс неколку пати со метанол. Сонирајте ги колбите со метанол 5 минути или подолго. Се препорачува да имате посветен клип што се чува чист.
    2. Во колбата додадете 100 ml метанол.
    3. 5 ml оцетна киселина.
    4. 3 ml APTES (3-аминопропилтриметоксисилан) и нежно протресете.
  3. Амино силинизација. Заменете го метанолот во садовите што содржат слајдови за боење и навлаки за покривање со мешавина од реакција на аминосилизација.
    1. Инкубација 20-30 мин. За време на инкубација, соникирајте еднаш за 1 мин.
  4. Исплакнете со метанол. Заменете ја реакцијата на еинонизинизација со метанол. Отфрлете го метанолот и додадете нов раствор на метанол. Повторете го овој процес три пати.

4. Површинска пасивација со употреба на полимер (прва рунда)

Пасивирајте ја амин обложената површина на кварцните слајдови и навлаки со конјугирање на NHS естер полиетилен гликол (PEG). Оваа реакција се изведува преку ноќ со концентрација на сатурација на растворот на PEG на pH 8,5.

Чувајте ги ПЕГилираните слајдови и навлаки за покривки во N 2 на -20ºС.

  1. Лизгалки за сушење и лизгалки на капакот. Внимателно расклопете го лизгачот и лизгачот со поместување на навлаката на едната страна, исплакнете ги со MilliQ H 2 O и исушете ги со N 2.
  2. Зачувајте слајдови и прекривки. За непосредна употреба, следете го процесот за вториот круг на PEGylation (чекор 6). За да заштедите подолг временски период, следете ги следните чекори.
    1. Ставете пар слајд и лизгање на капакот во цевка од 50 ml така што PEGylated површините да бидат свртени едни на други.
    2. Делумно затворете ја цевката, исчистете ја цевката со правосмукалка и наполнете ја со N 2. Овие чекори помагаат да се зачува ПЕГилираната област за подолг временски период. Зашрафете го цревото цврсто и чувајте го на -20 ° C. Квалитетот на фолиите останува добар до 3 месеци (Слика 3, десно).

6. Површинска пасивација со употреба на полимер (втор круг)

Друг круг на PEGylation за да се направи PEG слојот погуст и исто така да се изгаснат сите преостанати амино групи на површината. Употребата на кратки NHS естер PEG молекули (333 Da) ќе биде ефективна во продирање на постојниот слој PEG. Препорачливо е да го направите овој втор круг на PEGylation точно пред да направите слајд шоу.

  1. Подгответе тампон за реакција. Подгответе го свежиот тампон на натриум бикарбонат од 0,1 М (pH 8,5). Може да се користи и замрзнатиот раствор од чекор 4.2.
  2. Подгответе раствор на PEGylation. Растворете 7 μl од 250 mM MS4-PEG во 63 μl пуфер на натриум бикарбонат.
  3. ПЕГилација. Следете ја истата постапка како и во чекор 4.4. Инкубација 30 минути до ноќ.
  4. Лизгалки за сушење и лизгалки на капакот. Демонтирајте го пар лизгачот и лизгачот, исплакнете ги со MilliQ H 2 O, исушете ги со N 2 и чувајте ги во чиста кутија со пипети. За да соберете микрофлуидна комора, одете на чекор 7.

7. Соберете микрофлуидна комора

Соберете микрофлуидна комора со пар кварцен слајд и лизгач на капакот. Како дистанцер се користи двострана лента. Комората е запечатена со епоксидна и така се воведуваат раствори низ дупките на кварцниот слајд.

Рециклирани кварцни слајдови. Користените фолии се рециклираат со отстранување на лизгачите на капакот и двостраната леплива лента.

  1. По употребата, коморите складираат во вода од чешма. Долготрајната инкубација во вода го олеснува расклопувањето на коморите.
  2. Сварете ги коморите во вода од чешма користејќи микробранова печка. Користете чаша Пирекс. Гответе 10 минути или повеќе.
  3. Земете ги прекривките и двостраната лента со сечило за бричење. Туркате кварцен слајд не нормален на неговата рамнина. Во спротивно ќе се скрши. Држете го ножот за бричење надвор од каналот. Не грижи се, во спротивно ќе го изгреба каналот.
  4. Исплакнете ги слајдовите со детергент за домаќинство со триење со прстите.
  5. Лизнете во стаклена кивета. Типично може да се дадат 5 до 15 слајдови во еден сад. Во 10% чистач за домаќинство и соникирајте ги слајдовите 20 минути или подолго. Исплакнете со голема количина слајдови за вода.
  6. Одете на чекор 1.2.

Резултати од репрезентацијата

По уредувањето на микрофлуидната комора (чекори 7.1 до 7.6) и пред да се изврши чекор 7.7, препорачливо е да се изврши контрола на квалитетот на површината на PEG.

Ако површинската пасивација е извршена успешно, има помалку од 10 неспецифично апсорбирани протеини по површина за слики (25 mm x 25 mm) забележани кога 1-10 nM флуоресцентно обележани протеини (Слика 3, лево) стави во комората.

Ако еден од чекорите за прочистување или реакција не се спроведе правилно, бројот на неспецифично апсорбирани протеини се зголемува, а CCD-екранот може да стане заситен со флуоресцентни сигнали. На пример, ако оскопот од пирана е прескокнат, има 100 пати поголема количина на неспецифична апсорпција што е забележана (Слика 3а, со средно лево да се спореди). Ако се прескокне вториот чекор на PEGylation, забележана е приближно 3 пати поголема количина на неспецифична адсорпција (Слика 3б). Низок степен на PEGylation е забележан кога хемикалиите со истечен рок на траење (на пример, APTES се чувале на собна температура неколку месеци) (податоците не се прикажани). Квалитетот на површината исто така паѓа ако помина значителен временски период откако немаше PEGylated тип (Слика 3а, види. Лево Со десно).

Според наши сознанија, првпат се воведуваат два круга PEGylation за студии со една молекула. Двете рунди на PEGylation гарантираат највисок квалитет на формирање на PEG слој (Слика 3б). Супериорниот тип на двојна PEGylation е прикажан видливо во филмовите (сп. 1а филм Со Филм-1б). Во овие филмови, позадинските сигнали од флуоресцентни молекули забележани во раствор се користат да бидат многу послаби од двојната PEGylation, што значи дека протеините со тоа се одбиваат од двојната PEGylation. Иако постапката во два чекори е многу препорачана, вториот чекор на PEGylation може да се прескокне ако вашиот експеримент е толерантен за не-оптимална пасивација.

површината
Илустрација 1:. Шема за површински третмани (а) исчисти слајд со раствор на ацетон, KOH и пирана. Тој е функционализиран со PEG со APTES и PEG-NHS естер. (Б) Ливчето за покривање се чисти со KOH и, доколку е потребно, со раствор од пирана. Тој е функционализиран со PEG со APTES и PEG-NHS естер.

fig2highres.jpg "ширина =" 500 "/>Слика 2:. Микрофлуидна комора (а) Единечна канална комора. Лизгачот на микроскопот има две дупки дупчат во него. Монтиран е со лизгач на капакот со две стакла на двострана лента. (Б) Триканална комора. Лизгачот на микроскопот има шест дупки дупчат во него. Монтиран е со лизгач на капакот со четири стакла на двострана лента.

протокол
Слика 3: Слики на CCD со протеини обележани со боја, снимени во раствор. (А) Сликите на CCD се зафатени со раствор од вкупната внатрешна рефлексија на микроскопија на флуоресценција од типот на призма со 60X цел со 10 nM Cy3-ознака Rep. (Лево) А-површина е создадена според протоколот во овој напис. (Средна) Едната површина беше првично црвена според протоколот во овој напис, но го прескокна оренот од пирана (Десно) А-површината е подготвена според протоколот наведен во овој напис и се чува 3 месеци на -20ºС под азот. (Б) Слики на CCD снимени со 10 nM Cy3-ознака Реп во раствор. (Лево) А-површина е создадена според протоколот во овој напис. (Десно) А-површина беше подготвена според протоколот во овој напис, но вториот круг на PEGylation беше прескокнат. Скала лента = 5 μm.

Филм 1: CCD филмови со протеини обележани со боја, снимени во раствор. CCD-филмовите беа фатени во раствор со вкупна внатрешна рефлексија на микроскопија на флуоресценција од типот на призма со цел 60X со 10 nM Cy3-ознака Реп. Резолуцијата на времето е 100 ms. (А) Направена е површина според протоколот претставен во овој напис. (Б) А-површината беше подготвена според протоколот во овој напис, но вториот круг на PEGylation беше прескокнат. Кликнете овде за да го видите Филм-1а и кликнете овде за да видите Филм-1б.

Дискусија

Критични чекори во рамките на овој протокол

Важно е да се направи површината хидрофилна пред реакцијата на амино-силанизација. Ова беше постигнато преку гравирање на пирана, што создава слободни хидроксилни групи на површина од стакло/кварц. Препорачливо е да се држи пираната врежана површина на H 2 O или воздух долго време бидејќи хидрофиличноста на површината е изложена и се спушта.

Молекулите на NHS естер PEG се реактивни. Препорачливо е да се направат делумни количини и да се чуваат на -20 ° C под азот. Рок на траење на хемиските APTES на собна температура е низок. Се препорачува да го заменувате со нов секој месец.

Измени на овој протокол

Ако не користите гравирање на пирана, од која било практична причина, можете да гравирате со KOH подолг временски период (на пример, преку ноќ), што исто така ќе го направи изложен на хидроксилни групи. Стапицата на овој алтернативен пристап е што лизгачот станува неупотреблив по неколку враќања поради силните гребнатини.

Често се практикува да се запали стаклен/кварцен површински факел од пропан, што е ефикасно при отстранување на флуоресцентни органски материјали 7. Оваа постапка беше вклучена во овој протокол затоа што станува збор за излишно офорт на пирана. Забележете дека оваа постапка може да резултира со оксидација на хидроксилните групи. Затоа, оваа постапка не треба да се изведува доколку е врежана површина со употреба на раствор на KOH или пирана.

Кога се користи тампон со pH под 7 за сликање на единечна молекула, конформацијата се менува од PEG „печурка“ во „четка“, што укажува на степенот на пасивација. Затоа, ако се користи pH под 7,0, се препорачува површината со дискуцинимидил естер тартарат 7.

Перспективи

Оваа работа обезбеди робустен протокол за постигнување високо квалитетна пасивација на површината. Овој протокол ќе биде корисен за студии на флуоресценција на единечна молекула кои вклучуваат протеини 14 и 15 имуноципитирани со протеини, како и протеински комплекси во екстрактите од клетките. Широко се користи за други техники на единечна молекула, како што се спектроскопија на сила и вртежен момент 16 спектроскопија. Исто така, ќе се користи за да се спречи апсорпцијата на клетките на површината 17.

Протоколот даден во оваа теза бара негова постапка во повеќе чекори. Површинска пасивација со липид-ПЕГ-8 и поли-лизин-ПЕГ-9 се достапни како алтернативи. Бидејќи тие не бараат никакви хемиски реакции, лесно е да се имплементираат. Сепак, степенот на пасивација не е толку висок како оној што се постигнува со хемиска модификација на површината.

Откривање

Нема што да откриеме.

Признанија

SDC, ACH и CJ беа поддржани од Почетни грантови (ERC StG ​​- 2012-309509) од Европскиот совет за истражување. J.-MN беше поддржан од Националната фондација за истражување (NRF) (2011-0018198) Кореја; и Програмата за истражувачки центар за пионери (2012-009586) финансирана од НРФ на Кореја преку Министерството за наука, ИКТ и идно планирање (МСИП). Оваа работа беше поддржана и од Центарот за здравје Бионано-гарда на МСИП Кореја како проект за глобални граници (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL и J.-HH беа поддржани од Програмата за стипендии за наука во Сеул на градот Сеул, Кореја. Обележан Rep протеин беше дарежлив подарок од Др. Суа Мионг.