Презентирано од Мајкл Преукшас роден на Бремен - PDF бесплатно преземање
Деоксихипузин синтазата како можна цел за третман на мултиформениот глиобластом и улогата на факторот за иницијација на еукариотскиот превод eif-5a2 in vivo дисертација за да се добие титулата доктор на природни науки на Одделот за биологија, Математички факултет, компјутерски науки и природни науки, Универзитет во Хамбург претставено од Мајкл Преукшас роден на 27.09.2011 година во Бремен Хамбург 2012 година
Поправена верзија Датум на спор: 30.08.2013 година 1-ви рецензент: проф. Јоаким Хаубер 2-ри рецензент: проф. Д-р. Iaулија Кер ii
Големата трагедија на науката - убиство на една убава хипотеза од грд факт. „Томас Хенри Хаксли претседателско обраќање во британското здружение за 1870 година,„ Биогенеза и абиогенеза “(собрани есеи, том 8) iii
Список на кратенки 6! За време на оваа2 работа2произведени2 публикации2 и! Презентации на постери2. 2100 година! 7! Литература2. 2102 година! 8-ми! Додаток2. 2115 година! 8,1! Секвенца за почетници 2. 2115 година! 8,2! Лентирални2 вектори2. 2116 година! 8,3! 2. 2117 година! 8,4! Договор за осигурување2. 2122 година! iv
Список на кратенки TMZ TPZ WHO Темозоломид клетки кои размножуваат тумори Светска здравствена организација (Светска здравствена организација) iii
Резиме стои. Со помош на овој нокаут глушец, можно е да се добијат нови знаења за системските и специфичните органски функции кај цицачите. iii
Иницијацијата е делумно изразена на ниво на мрна, но скоро не може да се открие на ниво на протеини 5,6,8. И двата протеини се кодирани од сопствениот ген и секој е транскрибиран во пет записници. Транскрипциите понекогаш имаат различни 3 -UTR или се скратени, што има влијание врз стапката на превод и формирањето на полисомот на еиф-5а2-мрна, особено во случајот на транскриптите eif-5a2 и е евентуално вклучено во регулирањето на изразот 8 Еиф-5а2-мрна има и помала стабилност од онаа на еиф-5а. Така, се чини дека барем дел од различното изразување на двата изоформа се објаснува со овие пост-транскрипциски механизми. Ензимот DHS е одговорен за првиот чекор во синтезата на хипузин. Повеќето еукариоти имаат еден ген dhps, конзервиран во еукариоти и археи, што кодира DHS. Досега се пронајдени три варијанти на транскрипти кај луѓето, од кои, само една кодира активен протеин 9. Полиамин спермидинот служи како подлога за DHS. Трансферот на аминобутилскиот остаток од спермидин во еиф-5а-лизин 50 е NAD-зависен процес и во принцип е реверзибилен. DHS е a
Вовед во намалување на смртта на островските клетки на панкреасот поврзана со апоптозата. Улогата на еиф-5а во воспалителни реакции, кои се клучни за развој на дијабетес, се рефлектираше и во други сценарија. Орално администрирана форма на ЦНИ-1493 наречена CPSI-2364 беше тестирана за третман на Кронова болест, автоимуно хронично воспалително заболување на цревата. И тука беше прикажано антиинфламаторно дејство, кое беше поврзано со инхибиција на DHS. Хипотезата дека протеините eif-5a и ензимите кои формираат хипузин се вклучени во патогенезата на многу малигни неоплазми е поддржана од сè поголем број на студии. Евалуацијата на вклученоста на овие протеини во други видови карциноми беше очигледен избор. Тука, од посебен интерес беа малигните неоплазми, за кои досега беа достапни само неколку ефективни терапевтски опции. Овие вклучуваат, особено, тумори на мозок од повисок степен, чиј третман ретко е успешен, без оглед дали е хируршки, со класична радио/хемотерапија или насочени молекуларни терапии. Затоа, еиф-5а1/2, ДХС и ДОХХ се испитани како можни терапевтски цели кај астроцитомите од повисок степен. 9
Воведувањето на специфични онкогени кај секој пациент ќе биде потребно со оглед на хетерогеноста помеѓу туморите. Бидејќи постои и голема хетерогеност и веројатно клонален развој во рамките на GBM тумор 120 и честопати не може да се детектираат сите мутации со биопсија 121, новите економични технологии (на пр. Секвенционирање на егзомите) и насочувањето веројатно ќе бидат различни, непотребните цели помагаат да се надминат овие тешкотии. 18-ти
Материјал и методи 19 2 Материјал и методи 2.1 Материјал 2.1.1 Хемикалии и медиуми за бактерии Табела 2: Хемикалии и реагенси што се користат во оваа работа. Хемиски/реагенс/среден ацеглоу ECL-раствор на акриламид-бис, 30% адријамицин (доксорубицин) агароза ампицилин BCNU реагенс Бредфорд БСА бромофенол сини градови хлороформ хлороквин дифосфат ДЕПЦ-вода ДМЕМ + ацетал ексал глацијал ексал (ацетал) кисела киселина) Серум за теле (FCS) Глутаралдехид (50%) Глицин глицерин хемалум, до Мајер Изопропанол Ацетат на калиум Производител Peqlab Roth Sigma-Aldrich Invitrogen Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich Bio-Rad Roth Roth Roth Sigma-Aldrich Sigma Aldrogen Sigma Aldrogen Sigma Aldrogen Sigma Aldrogen Sigma Aldrogen Sigma Рот Рот Сигма-Олдрих Инвитроген Рот Рот Рот Рот Рот Рот Рот 19
Материјал и методи 20 Калиум хлорид LB агар LB медиум Обезмастено млеко во прав β-меркаптоетанол метанол (MeOH) M-MuLV натриум ацетат, натриум хлорид, натриум хидроксид, натриум orthovanadate не-есенцијални амино киселини Oligo d (t) Primer параформалдехид PBS Пеницилин/стрептомицин Riblockol Riblockolase Aidomycin ReasinOUT Rotiszint eco plus хлороводородна киселина (HCl) SDS SOC-Средна Спермамин Спермидин SYBR Green PCR Master Mix TEMED Temozolomide Tritium spermidine Tris Base Tris-HCl TriFast Roth Roth Roth Roth Roth Sigma-Aldrich JT Бејкер Ферментас Рот Рот .T.Т. Бејкер Сигма-Олдрих Гибко Инвитроген Сигма-Олдрих Лонза Гибко ГЕ здравствен инвитроген Сигма-Олдрих Сигма-Олдрих Рот Инвитроген Ферментас Рот Рот Рот Сигма-Олдрих Рот Инвитроген Рот Рот Финцими Рот Сигма-Алдрих Перкин-Елмер Сигма-Елмер Сигма-Елмер Сигма-Елмер Сигма-Елмерх Сигма-Елмерг Сигма
Материјали и методи 21 Трипан сино TritonX-100 0,5% трипсин + ЕДТА Твин20 Уреа Биохром Сигма-Олдрич Гибко Рот Сигма-Олдрих 21
Материјали и методи 22 2.1.2 Опрема и материјали Материјалите и опремата што не се наведени се стандардна лабораториска опрема Табела 3: Опрема и материјали што се користат во оваа работа. Опрема/материјали Cryovial CultureSlides, 4 комори Цитометар за проток FACSCalibur електрофореза комори FUSION SL Дополнителна документација за гел Кабинет Eagle Eye II GenePulser XCell хомогенизатор Omni TH Immobilon PVDF мембрана Mastercycler Градиент микро плочи читач Валак Виктор микроскоп Cell култура Акцетил Напојување за напојување, ND 1000 PowerPac NuPage полиакриламидни гелови ProteanXL Size ExtraThick Blot Paper Realtime PCR-Cycler Mx3000P X-ray филмови рендгенска касета TransBlot SemiDry-Blotter Tri-Carb 2900TR Vi-cell XR клетки културни колби, различни големини садови за култури и плочи Центрифуга 541010101010 Biosciences BD Biosciences Biorad/Invitrogen Peqlab Stratagene Biorad Omni International Milipore Eppendorf Perkin-Elmer Zeiss Millipore Roth Nalgene Peqlab Eppendorf Biorad Invitrogen Biorad Stratagene Thermo-Scientific Rego Biorad Perkin-Elmer Beckman-Coulman Beclman dt Sarstedt Eppendorf Eppendorf Sarstedt 22
Материјали и методи 23 2.1.3 Бафери и раствори Освен ако не е поинаку наведено, филтрираниот Millipore H 2 O се користеше за подготовка и растворите се чуваа на собна температура (РТ). "Табела 4: Користени пуфери и раствори Раствор Бактериска работа Раствор на суспензија Состав 50 mm Гликоза 25 mm Tris, pH 8,0 10 mm EDTA, pH 8,0 Складирање на 4 C тампон за алкална лиза 0,2 N NaOH 0,5% SDS тампон за врнежи 25% 5M KAc 15% HCl TE пуфер молекуларна биологија 50x TAE протеинска биохемија 100% трихлороцетна киселина (TCA ) 0,1 mm EDTA 10 mm Tris (pH 7,5) 242 g Tris основа 57,1 ml ацетат 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) H 2 O и 1000 ml 40 g TCA 20 ml H 2 O 0,5 M Tris, pH 6,8 50 mm DTT 6 g Tris основа 60 ml H 2 O pH 6,8 H 2 O и 100 ml 23
Материјали и методи 24 1,5 M Tris 27,23 g Tris база 80 ml H 2 O pH 8,8 H 2 O и 100 ml 5x SDS пуфер за трчање 360 g глицин 75 g Tris база H 2 O и 1000 ml пуфер за рамнотежа 1 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M уреа 20% глицерол (в/v) 2% SDS (w/v) 130 mm DTT рамнотежен пуфер 2 0,375 M Tris-HCl (ph 8,8) 6 M уреа 20% глицерол (в/v) 2% СДС (напон/напон) 135 мм јодоацетамид PBST 2000 мл PBS 1 мл Tween20 уреа пуфер 8 М уреа 2 М тиуреа 2% ГЛАВИ 50 мм ДТТ полусув пуфер за размачкување 25 g сдс 5,82 г Трис база 2,93 g глицин 1,90 ml 20% SDS 200 ml метанол H 2 O и 1000 ml складирање на 4 C 24
Материјал и методи 25 Буфер за лизирање на клетки (RIPA) 150 μl 1 M NaCl 50 μl 1 M Tris-HCl (ph 7,6) 50 μl 20% Неидентен P40 (в/v) 25 μl 10% Na деоксихолат (в/в) 10 μl инхибитор на протеаза и 1000 μl H 2 O клеточен циклус, апоптоза и стареење ДНК екстракција пуфер 192 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 8 ml 0,1% Triton X-100 (v/v) pH 7,8 раствор на пропидиум јодид 200 μg пропидиум јодид 1 mg RNase 10 ml PBS фиксирачки раствор 0,25% глутаралдехид (250 μl) 2% параформалдехид (1 g) PBS (pH 5,5; 50 ml) 20x калиум цијанид (KC) 820 mg K 3 F (CN) 6 1050 mg K 4 FE (CN) 6 x 3H 2 O 25 ml PBS 40x X-GAL 40 mg 5-бромо-4-хлоро-3-индолил β-d-галактозид 1 ml N, N-диметилформамид 2.1.4 Олигонуклеотиди Олигонуклеотидите користени Дизајнирано со користење на софтвер Primer3 122 ако е можно. Карактеристиките на букварите за хомологните рекомбинации (особено тенденцијата за формирање на димери) беа утврдени со софтверот Олигоанализатор 1.2 (Freeware, T. Kuulasmaa, University of Turku, Finland). 25-ти
Материјал и методи 26 2.1.5 Антитела Табела 5: Примарни и секундарни антитела што се користат за имуноблоти и FACS апликации. Дадени се целните протеини, домаќинот на потекло, употребената разредување и производителот. Производител на анти-глушец HRP овци производител за разредување на антитела 1: 10000 GE Healthcare Anti-Rabbit HRP Goat 1: 10000 Technology Cell Signal Technologies Anti-eIF-5A зајак 1: 5000 Novus Anti-DHS зајак 1: 1000 зајак Santa-Cruz Anti-DOHH Зајак 1: 1000 Eurogentec Anti-p53 зајак 1: 1000 Санта Круз Anti-p21 Waf1/Cip1 зајак 1: 1000 Технологии за сигнализирање на клетки Анти-АКТ зајак 1: 1000 Технологии за сигнализација на ќелии Анти-ПАКТ зајак 1: 1000 Технологии за сигнализација на ќелии Анти-РБ зајак 1: 1000 технологија за сигнализација на клетки Anti-pRB зајак 1: 1000 технологија за сигнализација на клетки Анти-β-тубулин глушец 1: 10000 онкоген анти-активен-каспаза3-зајак 1: 5 БД Фарминген ПЕ IgG 1 -ПЕ Изотип глушец 1: 5 БД Фарминген Контрола 2.1.6 Медиуми за клеточна култура Табела 6: Средства за клеточна култура што се користат во оваа работа и нивниот состав. Раствор Глиомеддиум Состав Дулбекос модифициран орел медиум 4500 мг/л глукоза Л-глутамин 1 мм натриум пируват 1: 100 пеницилин/стрептомицин 10% СЦС астроцитен медиум ДМЕМ/Ф-12 4500 мг/л глукоза 1 мм Л-глутамин 26
Материјал и методи 27 1 mm натриум пируват 1: 100 пеницилин/стрептомицин 20% FCS DMEM медиум за раст Дулбекос модифициран Eagle медиум 4500 mg/l глукоза 1 mm L-глутамин 1: 100 пеницилин/стрептомицин 10% FCS (20% FCS за NHAs) медиум замрзнување FCS 10% DMSO DMEM-ES медиум Дулбеко модифициран орел медиум (25 mm HEPES) 15% FCS 2 mm L-глутамин 0,1mM MEM 0,05 mg/ml мешавина на нуклеозид од пеницилин/стрептомицин (аденозин 1,3 μg/ml; гванозин 1, 37µg/ml; цитидин 1,18µg/ml; уридин 1,18µg/ml; тимидин 0,38µg/ml) 1 мм натриум пируват 100 µm 2-меркаптоетанол 1000 U/ml ESGRO-LIF додаток за избор по избор: 150 250 μg/ml G418 Средство KSOM/HEPES, pH 7,4 95 mm NaCl 2,5 mm KCl 350 μm KH4PO4 200 μm MgSO 4 медиум за MEF (фидер-клетки) DMEM 9% FBS 0,1 mm NEAA 50 U пеницилин/50 μg/ml стрептомицин Мембрана на ембрионални матични клетки 27
Материјали и методи 28 DMEM 25 mm HEPES 15% FBS 2 mm L-глутамин 0,1 mm NEAA 50 U пеницилин/50 µg/ml мешавина на нуклеозид од стрептомицин (1,3 μg/ml аденозин; 1,37 μg/ml гванозин; 1, 18 µg/ml цитидин; 1,18 µg/ml уридин; 0,38 µg/ml тимидин) 1 мм натриум пируват 100 μm β-меркаптоетанол 1000 U/ml ESGRO-LIF 28
Материјал и методи 29 2.1.7 Користени клетки Клеточните линии и примарните клетки што се користат во оваа работа се наведени во Табела 7. Примарните ембрионални фибробласти на глувци (MEF) исто така беа користени како фидер-клетки за одгледување на ES клетки. Табела 7: Клеточни линии што се користат во оваа работа, како и нивните хранливи материи и потекло. Средни извори на мобилна линија Phoenix Eco ϕ - (Изменет HEK293T, стабилно трансфектиран со два плазмиди кои кодираат МКМ вирусни секвенци за „gag“, „pol“ и „env“.) Универзитет Стенфорд (ДМЕМ) U87-MG (придружна клеточна линија на човечки астроцитом), изолиран од астроцитома на СЗО IV степен. Релевантни мутации: Избришано место Инк4Арф) Глиома медиум ATCC (број: HTB- 14) G55T2 (приврзана клеточна линија на човечки астроцитом, изолиран од астроцитома на СЗО од степен IV. Релевантни мутации: Избришано место Инк4Арф, p53- мутација на точката во доменот на врзување за ДНК) Глиомедиум неврохирургија, Универзитетски медицински центар Хамбург-Епендорф; Вестфал 1994 NHA (нормални човечки астроцити, примарни, диференцирани астроцити од човечко мозочно ткиво) астроцитен медиум Инвитроген (Дармштат; N7805-100) C57BL/6N JM8.F6 клетки (ембрионални матични клетки на глувци) медиум DMEM-ES W. Skarnes, Wellcome Trust Sanger Институт, Калифорнија, САД 29
Материјал и методи се користени 36 гелови полиакриламид од страна на SDS-Page 12 за електрофоретичко одвојување на протеините. Стаклените плочи беа ставени во штандот за леење и гелот за одвојување (10 ml) се мешаше од следниве раствори: 3,35 ml H 2 O 4 ml 30% акриламид 2,5 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) 50 μl 20% SDS 50 μl 10% APS 10 μl TEMED Смесата се истури помеѓу стаклените плочи и се покрива со 1 ml изопропанол се додека не се полимеризира по околу 20 минути. Гел за собирање (4%, 5 ml) беше составен во меѓувреме: 3,05 ml H 2 O 0,66 ml 30% акриламид 1,25 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) 25 μl 20% SDS 5 μl TEMED По отстранувањето на изопропанолот и испирање на гелот за одвојување со вода, гелот за собирање се истури врз гелот за одвојување и се вметна џебниот чешел (10 џебови, дебел 1,5 мм). По 20, гелот беше ставен во комората за трчање и тоа се наполни со пуфер за течење. Подготовка на примерок 5x тампон за полнење и 20x агент за денатурирање (обајцата од Ферментас, Св. Леон-Рот) се мешаат со посакуваниот волумен на протеин лизат и се пополнуваат до посакуваниот волумен (10 50 μl) со RIPA пуфер. Смесата се вареше 5 минути на 95 ° C со цел да се денатурираат протеините и потоа се чува на мраз. 36
Резултати 73 АБ телесна тежина [g] 30 28 26 24 22 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 20 1 3 5 8 10 12 15 17 C 1,0 дена тежина на тумор [g] 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 PBS 0,1 mg GC7 0,15 mg GC7 0,2 mg GC7 Сл.: 20 Тест секвенца на in vivo експерименти со ксенографт и ефект на GC7 во in vivo G55T2 ксенографт модел врз тежината на животните и туморската маса. (А) Тест низа на in vivo експерименти со ксенографт со клетки G55T2. G55T2 клетките беа инјектирани субкутано грбно во глувци NSG. По успешен раст и формирање на тумор, GC7 беше администриран на ден. администриран. По седум дена од третманот, туморите беа подготвени, измерени, измерени и сочувани за екстракција на протеини/имунохистохемиско боење. Статусот на хипусин (а со тоа и ефектот на GC7) беше утврден со помош на 2D Western blot (B) Тек на телесната тежина на глувците NSG по поткожно вбризгување на клетки G55T2 и дневен третман со 0,1 mg, 0,15 mg, 0, 2 mg GC7 или PBS како контрола на растворувач (средно ± СЕМ). (C) тежина на туморот по 7 дена од третманот со GC7. (Тежина на индивидуалните тумори и просечна/група ± СЕМ). Третман видлив (на пример, бушаво крзно, подсечени области). BehaV 73, исто така
Резултати 75 3.3 Создавање нокаут глушец eif5a2 3.3.1 Создавање на целниот конструкт eif5a2 Врз основа на информациите за редоследот на генот eif5a2 (името на хомологот на глувчето кај човечкиот ген eif-5a), се избраа стратегијата за клонирање и регионот на низата што треба да се избрише. Оваа област вклучува егзони 1 3 и вклучува Сл .: 22 Шематски приказ на субкланирање со хомологна рекомбинација. Линеарен минимален вектор (црн) со хомологни региони (сино) до BAC е електропориран во клон E. coli кој носи BAC со ДНК сегментот да биде изменет (сив). со тоа започнува преводот и лизин 50 во егзон 2, што ја носи критичната модификација на хипозин. Како што е опишано во Дел 1.2.7, BAC RP23-361F2 служи како почетна точка за клонирање на векторскиот конструкт. Тука е користен методот на рекомбинирање (клонирање со помош на хомологна рекомбинација) (прикажан како пример на слика: 22). Интегритетот на генот eif5a2 во BAC прво беше потврден со секвенционирање. Минималниот вектор pstartk потоа беше засилен со PCR и, со помош на букварите, беа додадени краци на хомологијата лоцирани 5 и 3 од генот eif5a2. Производот PCR беше анализиран со електрофореза на агарозен гел 75
Публикации и презентации на постери создадени за време на оваа работа 101 Сеопфатна мрежа на протеински интеракции на модификација на хипозин поврзана со карцином. Sievert H, Venz S, Platas Barradas O, Schaletzky M, Preukschas M, Bokemeyer C, Pörtner R, Walther R, Balabanov S (2011): EMBO Conference Cancer Proteomics 2011 презентација на постер Секреторен фенотип (TASP) поврзан со теломер соработува со BCR- АБЛ да вози малигна пролиферација на матични хематопоетски матични клетки Мелани Брег, Нора Полман, Мајкл Преукшас, Дорис Стајнман, Ана Гомпф, Карл Л. Рудолф, Андреас Шуперт, Стефан Балабанов и Тим Х. Бримендорф Излагање за постер во подготовка 101
Додаток 115 8 Додаток2 8.1 Редослед на прајмери еф5а2 нокаут конструкција: Буквар за секвенционирање на имиња eif5a2 во pstartk pstartrev-seq1-r pstart-k Seq fwd Буквар за додавање на хомолошки краци на eif5a2 или на касетите за отпор A2 буквар A2 буквар 2 eif5a2 -за eif5a2-kanneo-loxp-rev eif5a2-kanneo-frt-f eif5a2-kanneo-frt-r прајмер за сонда 3'-сонда3-f 3'-сонда3-f Понатамошни буквари за секвенционирање pws-tk6-ori-f A2-TK6-Ори -r А2-A2 TK6-3'-F-r-TK6-3 'секвенцата (5'-3') tgacagcagacgtgcactgg CTC GGG CCC АЦВ тата ATG ОД gagcccctcctgtacagcctgggtgttggtgaagggggaatccaagagttacgc GTcgactgaattggttcctttaaagc gagacagacgagttaaggagatacaagaggaaagaaggaagatggaggaa gccgcactcgagatatctagaccca aactgaagatgaggatgcatctcgcccgggaacactgcgaagcttcaaacaattaa ccctcactaaagggcg gtgctgcggattagtgcacttccggcgtgcagagctgcctgcagtcgacttaatacga ctcactatagggctc CTAGGGCCGGCCATTAATaattaaccctcactaaag CTAGTTAATTAAAAGCTTGTTAACtaatacgactcactatag cacacattacatgaattataagg ctgtcccagctcttaactgc gtgagcgaggaagcggaatatatc catccgtcagtctagtaatttcc gggaaatg tggattgctgtc tataaacccgcagtagcgtg 115