Прочистување на протеини - биологија

Прочистување на протеини (исто така Прочистување на протеини) го опишува процесот на збогатување и прочистување на еден или повеќе протеини од комплексна биолошка мешавина или раствор што содржи неколку биомолекули. Ова збогатување може да се одвива во неколку последователни чекори на чистење со употреба на различни методи на чистење, чијашто ефикасност (значајната низа) и нивната ефикасност (степенот на чистење) се следат и квантифицираат со аналитички методи.

Принципи на поделба

Со цел да се одделат протеините, се искористуваат нивните различни карактеристики поради низата и специфичната структура. Во јонска размена на хроматографија и изоелектрично фокусирање, ова е изоелектрична точка, во SDS-PAGE молекуларната маса и пост-преведувачките модификации, во исклучена големина хроматографија и центрифугирање на молекуларната маса и конформацијата. Изопицичната центрифугација се одделува врз основа на густината. Афинитетната хроматографија ги користи разликите во афинитетот за селективен лиганд или во соодветните константи на дисоцијација. Хидрофобната, обратната фаза и поларната хроматографија се одделуваат според поларитетот на различните изложени поларни аминокиселини и пост-преведувачките модификации. Врнежите со космотропни соли [1] од серијата Хофмајстер, органски растворливи во вода органски растворувачи или температура се засноваат на променетата растворливост. Екстракцијата со екстракант (обично друга фаза) или полиетилен гликол [1] се заснова на поларитетот и различните растворливости во растворувач или детергент, како на пр. Б. Мешавини на фенол, хлороформ и изоамил алкохол (со или без хаотропи како што е гванидиниум тиоцијанат [2]) или фазно одвојување на еден процент (m/V) раствори на Тритон Х-114 на 4 ° С. [3] [4] [5] [6]

Обично се вршат неколку методи во серија, изборот на методот зависи од својствата на протеинот, соодветните зависни од методот придружни супстанции зависни од методот за следните постапки и какво било придружно денатурација. Повисоките степени на прочистување (или факторите на прочистување) на еден процес овозможуваат помал број на чекори на прочистување, на пр. Б. со Тандем афинитет прочистување.

Бидејќи протеините што треба да се прочистат, претежно рекомбинантните протеини, се загрозени со инактивација, денатурација или протеолиза при нарушување на клетките, прочистувањето на протеините често се изведува брзо на 4 ° C. во присуство на инхибитори на протеазата. Некои инхибитори на протеаза се користат само ако функцијата на протеинот што треба да се прочисти не е нарушена или одржувањето на неговата функција е незначително, бидејќи тие можат да го модифицираат протеинот преку ковалентна врска.

Процес на раздвојување

Хроматографија

Хроматографија со јонска размена (IEX)
Хроматографија со исклучок на големината (ДИК)
Афинитетна хроматографија
поларна хроматографија
Хидрофобна интеракција хроматографија (HIC) и обратна фаза хроматографија (RPC)

Електрофореза

Екстракција и врнежи

сериски екстракции
сериски врнежи

Филтрација

дијализа
Филтрација на тангенцијален проток
Микрофилтрација

таложење

Центрифугирање
Анализи на пулдаун
со помош на антитела: МАКС, анализи на монистра и имуно-врнежи

Испарување

Постапка за верификација

По одделните фази на прочистување на протеините, прочистените протеини се карактеризираат и квантифицираат. Ефикасноста на целото прочистување се определува со рамнотежата, со одреден степен на прочистување (како реципроцитет на масовната фракција) од протеинската маса, или - во случај на ензими - исто така, може да се одреди одреден степен на прочистување од ензимските активности, на пр. Б. количникот на вкупната маса на прочистен протеин и почетната маса на предметниот протеин во почетниот материјал или аналогниот количник формиран со активностите.