Студии за антиоксиданс ефективноста на состојките на полифенолниот сок од јаболко во
Студии за антиоксидантната ефикасност на полифенолните сокови од сок од јаболко во клетките на човечкото дебело црево Дисертација одобрена од одделот за хемија на Техничкиот универзитет во Кајзерслаутерн за доделување на академски степен Доктор на природни науки (Д386) поднесена од дипломирана хемичарка за храна Сандра Шофер Кајзерслаутерн, 2006
Сегашната работа е создадена помеѓу јуни 2002 и ноември 2005 година во одделот за хемија, хемија на храна и токсикологија на животната средина на Техничкиот универзитет во Кајзерслаутерн. Ден на научна дискусија: 25 април 2006 година Претседател на Комитетот за испит: проф. Д-р. Х. Сицман Прв известувач: Проф. Др. Г. Ајзенбранд 2-ри известувач: проф. Д-р Д. Шренк Му благодарам на проф. Г. Ајзенбранд и Др. Ц.Јанзовски за обезбедување на темата и за предлози и добронамерна поддршка за време на докторскиот период.
Содржина 5.5.2.1 Додавање на аскорбинска киселина. 152 5.5.7.1 зависност од рН и реверзибилност. 154 5.5.8 РЕЗИМЕ НА СТАБИЛНОСТА НА ПЛИФЕНЛИТЕ 157 6 ДИСКУСИН И УТВРДУВАЕ. 158 7 РЕЗИМЕ. 168 8 СПИСОК ЗА ЛИТЕРАТУРА. 170 9 ПРИЛОГ. Јас 9.1. ИЛУСТРАЦИИ НЕ ПОКАOWNАНИ. Јас 9,2 CV. V 9.3 ПОДНЕСУВАА НА ПСТЕР И ОБЈАВУВАА. VI
Список на кратенки ph pk a PKA PKC PKZ Plt Plz Que, QQ - Qq ra (p) e RS RP RT Rut SD SE SGLT1 SD SRB SSA SSB SULT TAC TBARS TEAC TCA TEA tgsh TI% TNB TRAP Tris UDPGT UDP VdF Логарит на концентрација на водород Кисела дисоцијација на протеини киназа А протеинска киназа Ц примарни (човечки) клетки на дебелото црево флоретин флоридин кверцетин кверцетин-о-семикинон кверцетикинон реконституирани мешавини на екстрактен сок од јаболко (математика) реактивни видови кислород, вкл. за реактивни видови кислород време на задржување на обратна фаза рутин стандардно отстапување за стандардна грешка во стандардна девијација за стандардна грешка транспортер на гликоза зависен од натриум супероксид дисмутаза сулфорозамин Б сулфосалицилна киселина прекин на единечно влакно, вкл. за пауза на една жичка фенол сулфат трансфераза вкупен антиоксидантен капацитет тиобарбитурна киселина реактивни супстанции Тролокс еквивалентен антиоксидантен капацитет трихлороцетна киселина триетаноламин вкупен глутатион Интензитет на опашката, ингл. за интензитет на опашката потенцијал за апсење на 5-тио-2-нитробензоат, вкупен пероксил радикал, трис (хидроксиметил) аминоетан UDP-глукуронил трансфераза урацил дифосфат Здружение на германската индустрија на овошни сокови е.в.
Теоретските основи може да се спречат со соодветна диета и начин на живот [Доналдсон, 2004]. Молекуларни механизми на карциногенеза на дебелото црево Карциногенезата е повеќестепен процес кој вклучува молекуларни и клеточни промени. Процесот може да се подели во три поврзани фази: Иницирање на тумор, промоција, прогресија (Слика 3.3). I N I T I A T I N P R M T I N нормална клеточна мутација на гени кои го регулираат растот: АПЦ, К-рас и сл. Инициран избор на клетки раст на иницирани клетки аберантна мутација на фокуси на криптите, бришење DCC, p53 предизвикува ендоген генотокс на FAP, HNPCC. Субст. Вируси РС Медијатори на воспаленија Оштетување на ткивата, CU, MC Аденом П Р Г Р Е С С И Н Избор метастази на инвазија на карцином Слика 3.3: Повеќестепен процес на развој на карцином на дебело црево, модифициран од [Шулт-Херман и сор., 2004]; Кратенки: АПЦ: аденоматозна полипоза коли; FAP: синдром на семејна аденоматозна полипоза; HNPCC: синдром на нелипозен колоректален карцином; CU: улцеративен колитис; MC: Кронова болест; DCC: избришан во карцином на дебело црево 9
Теоретски принципи Со голема потрошувачка на протеини, постои зголемен трансфер на протеини, пептиди и уреа во дебелото црево. Бактерискиот метаболизам, меѓу другото, произведува амониум катјонски (NH + 4). Ова е цитотоксично во експерименти врз животни и може да игра улога во карциногенезата. [Биесалски, 1999] 12
Теоретска основа NADP + NADPH FAD црвен FAD восок липидна пероксидација хинон полухинон радикален редокс ензим за циклус деактивирање H реакција на Хабер-Вајс 2 оштетување на ДНК Fe реакција на Фентон Fe 2 - H 2 2 SD 2 2 CAT GSH NADP + GPx GSR H 2 GSSG NADPH Слика 3.4: Примери за развој на разни РС, одбранбени механизми и оштетувања (зелено: детоксикација, црвено: директни последици од реакции на РС; изменето од [Кели и сор., 1998, Сис, 1985]; CAT: каталаза, GSH: намален глутатион, GSSG: оксидиран глутатион, GPx: глутатион пероксидаза, GSR: глутатион редуктаза, СД: супероксид дисмутаза, CYP: цитохром Р450-зависни монооксигенази Хидроксил радикалот H делува како најреактивен вид кислород [Сијес, 1991] со стандарден потенцијал за намалување од 2,31 V силно оксидира Halliwell и Gutteridge, 1999]. H може да се појави во многу биолошки релевантни системи, како на пример преку реакција на тешки метали јон-катализирана Хабер-Вајс (на пример, со бакар или железо - Еквивалент 3.7) од 2 и H2 2. Делумната реакција катализирана со јон на железо е позната и како реакција на Фентон (Eq. 3.6) [Ајзенбранд и Мецлер, 2005]. 2 - + Fe 3+ 2 + Fe 2+ (3,5) Fe 2+ + H 2 2 H + H - + Fe 3+ (3,6) 2 - + H2 2 H + H - + 2 (3,7) 14
Теоретски основи 3.3. Оксидативен стрес и неговите последици 3.3.1 Липидна пероксидација (ЛП) Важната улога на липидите во клеточните компоненти ја потенцира важноста на нивното можно оштетување со оксидација во биолошките системи. Оваа реакција на оксидација, исто така наречена LP верижна реакција, е поделена на три фази: иницирање, размножување, завршување и е прикажано шематски на слика 3.5. LH R RH Иницијација LH L 2 LH Продолжување на синџирот L X Стабилен производ за завршување Слика 3.5: Преглед на LP, според [Kelly et al., 1998]; LH: масна киселина; Р: реактивни видови; X: молекула со која Л реагира. Верижната реакција ја започнуваат реактивни видови кои можат да апстрахираат атом на водород од метиленска група (иницијација). H започне верижни реакции со сите масни киселини, додека 2 реагира само со некои, особено активирани, масни киселини [Халивел и Гатериџ, 1999]. Ова создава радикали на алкил и пероксил, кои потоа реагираат со други масни киселини. Радикалната верижна реакција се разгранува преку распаѓање на пероксиди, од кои произлегуваат по два радикали (размножување). Пауза од синџирот се јавува преку реакција на радикалите со молекули кои формираат стабилни производи (завршување). [Белиц и сор., 2001 година, Кели и сор., 1998] 17
Теоретски основи Идеални подлоги за ЛП се полинезаситени масни киселини со бисалилни метиленски групи. На овие позиции јаглерод-водородните врски имаат мала енергија на дисоцијација, така што апстракцијата на водород од радикални реакции е лесно можна. [Кели и др., 1998] Липидната пероксидација и фрагментацијата поврзана со него резултираат во широк спектар на заситени и незаситени молекули, на пр. Алкани, алдехиди, кетони и фурани [Белиц и сор., 2001]. Покрај својствата како компоненти на аромата, овие реактивни молекули можат да имаат и цитотоксични, генотоксични и мутагени ефекти [Марнет, 1999]. Формирањето на малонидијалдехид (МДА) треба да се објасни како пример за LP производ: R 2, 2 RH CCH 3 ланец продолжување CCH 3 циклизација CCH 3 2, RH R CCH 3 H топлина, H + CCH 3 фрагментација малондијалдехид + H CCH 3 Слика 3.6: Формирање на малондијалдехид (МДА) од α-линоленска киселина, според [Белиц и сор., 2001] МДА се формира од полинезаситени масни киселини преку реакција со радикал на пероксил, кислород, последователна циклизација и фрагментација (Слика 18
Теоретски принципи NH 2 NH 2 HN NHNNNNNH 2 NNHHNNHNNH 8-хидроксигуанин 2-хидроксиаденин 8-yјаденин HN NH CH 3 HHH HN NHHHNH 2 HN HNN NH 2 CH тимин гликол 5- (хидроксиметил-хидроксино-хианоил-2ацил-2-хиацил 2) 5-формамидопиридин Слика 3.7: Примери на оксидирани пиримидини и пурини, според [Менегини, 1997]. Напад од страна на Д може да резултира со различни производи, на пр. Оксидација на гванин во позиција 4, 5 или 8 (8-хо-деоксигванин или 8-хидроксидесоксигуанин, 8-H-dG) на пуринскиот прстен, што доведува до прстенести производи како 2,6-дијамино-4-хидрокси-5-формамидопиримидин ( FaPy) продолжуваат да реагираат (слика 3.8). Напад врз пиримидини исто така може да доведе до базни димери. [Халивел и Гатериџ, 1999 година, Јаруга и Диздароглу, 1996 година, Кели и др., 1998] HN NH 2 NNNR деоксигуанин оксидација H редукција NH 2 HN NNNR отворање прстен NH 2 HN NNNRHH 8 HG NH 2 HN NCNNRHH + e -, + H + + e -, + H + + e -, + H + NH 2 HN NN NH R Отворање на прстен NH 2 HN NNNRHHNH 2 HN NNNRH Фапи 8-H-dG Слика 3.8: Модификации на деоксигванин од страна на радикалите H, според [Халивел и Гутриџ, 1999] 20
Теоретски основи Системите за поправка на ДНК за поправка на ДНК препознаваат модифицирани и неусогласени ДНК бази. Ваквите модификации се главно оксидирани бази [Кристман и сор., 2003]. Кога оштетената база е препознаена и исечена од ДНК гликозилазата, се создаваат таканаречени места на апурин/апиримидин (АП) и се става во движење каскадата за поправка на поправка на основната ексцизија (БЕР), најважниот систем за поправка на оштетувањето на оксидативната ДНК ( Слика 3.11). ДНК гликозилаза АП лиаза ДНК гликозилаза АП лиаза APE1 APE1 Pol δ/ε Polβ Polβ Fen-1/PCNA Polβ Lig1 Lig3 Слика 3.11: шематски приказ на БЕР, според [Шарер, 2003]; зелена: кратка лепенка - патека, виолетова долга патека; Кратенки во текстот. АП ендонуклеаза-1 (АПЕ1) ја хидролизира фосфатната врска од 5-та страна на абазичните места. Полимеразата β (Polβ) внесува нуклеотид во низа на абазичното место и потоа го отстранува абазичното место поради неговата активност на АП лиаза. ДНК лигазата III (Lig3) го затвора никот и со тоа ја враќа оригиналната ДНК секвенца. Ако БЕР е предизвикан од бифункционални ДНК гликозилази/АПЛјази 25
Теоретска позиција [Манах и сор., 2004]. Покрај тоа, можни се и гранки и врски со нефлавоноиди. Проантоцијанидините придонесуваат за горчлив и адстрингентен вкус во растителната храна [Јоргенсен и сор., 2004]. Кај јаболковите јаболка, степенот на полимеризација е главно помеѓу четири и единаесет единици на флаванол [Manach et al., 2004]. 3.4.1.2 Деривати на флоретин Флоретин и неговите гликозиди (главно флоретин-2-глукозид = флоридин и флоретин-2-ксилоглукозид) припаѓаат на дихидрохалконите, нивната структура е прикажана на слика 3.13. H H H R R = H: флоретин R = гликоза: флоридзин Слика 3.13: Структура на флоретин и флоридин Тие се јавуваат природно скоро исклучиво кај јаболката, како и во лисјата и кората на јаболкницата. Друга точка на потекло за флоретин е микробното распаѓање на апигенинот во дебелото црево (Поглавје 3.4.4). 3.4.1.3 Деривати на хидроксицинаминска киселина Една од најчестите хидроксицинамински киселини е кофеинската киселина, која обично се наоѓа во природата естерифицирана со кининска киселина или со гликоза. 5-кафефеил-кинична киселина е позната и под името хлорогена киселина (Слика 3.14). 30-ти
Теоретски основи HHRR = H: кофеинска киселина R = кининска киселина (C5): хлорогена киселина HH 4 5 2 3 1 6 HH кинична киселина CH Слика 3.14: Структури на кофеинска киселина и хлорогена киселина според [Белиц и др., 2001] Хлорогената киселина главно се наоѓа во кафето и јаболката, но исто така и во други плодови од камен и камен [Белиц и сор., 2001, Иваи и сор., 2004]. Во силно кафе, може да се постигнат нивоа до 500-800 mg/l [lthof et al., 2003]. Не-кафе алкохолисти внесуваат до 100 мг хлорогена киселина дневно, кафе-алкохоличари, од друга страна, 500-1,000 mg/d [Lthof et al., 2001]. 3.4.2 Апсорпција Бидејќи на фенолните соединенија им се припишуваат биоактивни ефекти in vivo, апсорпцијата во тенкото црево е предуслов. Слика 3.15 ги илустрира можните патеки на полифенолите од храната во гастроинтестиналниот тракт. Полифеноли Полфеноли Ткиво Тенкото црево Дебели во дебелото црево Дебели измет во бубрезите Урина Слика 3.15: Можни патеки на полифеноли кај луѓето, според [Скалберт и Вилијамсон, 2000] Степенот и механизмот на внесување се контроверзни (Табела 3.3) 31
Теоретска основа Табела 3.3: Избор на in vivo и in vitro студии за навлегување на деривати на кверцетин Студија навлегување на супстанции Метаболити Литература илеостома пациенти Кверцетин 1 гликозиди кромид Рутин 24% 52% 17% [Холман и сор., 1995] Тест субјекти (плазма над 24 часа Гликозиди кромид рутин гликозиди јаболко