Студии за дистрибуција на имуните клетки во периферната крв во дебели предизвикани од диета
1 Од Институтот за анатомија и клеточна биологија на Медицинскиот факултет на Универзитетот Мартин Лутер Хале-Витенберг Директор: проф. медицински Хајке Киелштајн Истражувања за дистрибуција на имунолошки клетки во периферната крв во диета-индуциран дебел стаорец по индукција на тумор роден во Фрајберг (Саксонија) Рецензент: 1. Проф. медицински Хајке Киелштајн 2. ПД Др. медицински Ханс-Јирген Сејфарт (Лајпциг) 3. Проф. медицински Торалф Ланге (Вајсенфес)
5 покажа метастази во белите дробови кај дебели животни. Овие првично забележливи нумерички ограничувања на НК клетките и моноцитите исто така може да бидат одговорни за фактот дека решавањето на клетките MADB106 во белите дробови и со тоа формирањето на белодробни метастази кај дебелите животни е првенствено можно и напредува побрзо.
Содржина I Содржина I Содржина Страна 1. Вовед Дебелина на масното ткиво Влијание на адипокините врз имуните клетки Дебели асоцирани заболувања на туморот Цел Материјал и методи Тест на животни и сточарство Експериментално поставување Модел на тумор Инјектирање на клетки MADB106 или собирање на NaCl и анализа на примерок материјал Отстранување на крв и органи Извлекување липиди и утврдување на концентрацијата Имунолошки тестови Изолација на PBMC и лиза на еритроцити според Швинцер Определување на бројот на PBMC со помош на комора за броење на Неубауер Боење на специфични имунолошки клетки со употреба на антитела споени со флуорохром Цитометриски мерења на проток со проценка на FACS ФАКС Квантификација на НК клетки, туморски клетки и контактни клетки со туморски клетки на НК или површни метастази во Ткиво на белите дробови Определување на релативната концентрација на мрна во ткивото на слезината кај стаорци со нормална тежина или дебели F344 стаорци со користење на PCR статистика во реално време 26
8 содржини II 3. Резултати Развој на телесната тежина на животните кои се испитуваат Краткорочен експеримент Долгорочен експеримент Концентрации на триглицерид и холестерол во црниот дроб Сортер на активирани клетки со флуорезенс (FACS) - мерења на краткорочен експеримент НК клетки Б лимфоцити Т лимфоцити цитотоксични (CD8 +) Т -Моноцити на клетките на Т-помошни клетки (ЦД4 +) Сортер на активирани клетки на Флуорезенс (ФАКС) - мерења на долгорочен експеримент НК-клетки Б-лимфоцити Т-лимфоцити Цитотоксични (ЦД8 +) Т-клетки Т-помошни клетки (ЦД4 +) моноцити квантификација на НК клетки MADB106 клетки и интеракција на НК-клетки-туморски клетки, како и површни метастази во белите дробови Релативна концентрација на мрна на активирање и инхибиција на рецептори на НК-клетки и на цитокини специфични за НК-клетки во ткивото на слезината Релативни концентрации на МРН во краткотрајниот експеримент Концентрации во долгорочниот експеримент Резиме на дискусијата Библиографија 58
9 Содржина III 7. Тези 68 Декларација за независност Декларација за претходни докторски обиди Табеларна биографија благодарници
10 Список на кратенки IV Список на кратенки ANOVA APC BMI CD CFSE CRP DIO FACS FITC IFNγ IL i.v. JAK-STAT KIR MALT MCP-1 MHC MP-NK клетки mrna Ms IgM/G NaCl NKG2D NK клетки PBS PBMC PCR PE анализа на варијанса алофикоцијанин индекс на телесна маса Кластер на диференцијација карбоксифлуоресцеин суцинимидил естер Ц-реактивен протеин предизвикана од диета Активиран сортирање на клетки, флуоресцеин изотиоцијанат интерферон гама интерлеукин интравенски Јанускиназа - Сигнал трансдуцери и активатори на рецептори убиец-клетки слични на имуноглобулин Мукоза асоцирани лимфоидни ткива моноцити хемотактички протеини-1 најголем хистокомпатибилен комплекс-маглунга-маглунти-магло-маглунти-магло-маглунти-компоненти на масти Група убијци 2, член Д Природни клетки убијци реакција на фосфат со солена сол, периферна крв, мононуклеарна клетка полимераза верижна реакција фикоеритрин
11 Список на кратенки V PE-Cy7 Phycoerithrin-Cyanin 7 PPARγ RPMI Medium SEM Peroxysome Proliferator Activate Receptor-Gamma Roswell Park Memorial Institute Medium Стандардна грешка на средните T H1/2 T помошни клетки 1/2 T Reg TNFα WHO T тумори на регулаторот -Фактор на некроза Алфа Светска здравствена организација
32 Толкување на материјал и методи 21. Конечно, утврдените својства на клетките беа презентирани во форма на хистограм или запис за точки. На овој начин, повеќе од десет илјади клетки може да се доделат на одредена популација или под-популација за помалку од една минута. Сл. 5: Шематски приказ на методот на проточна цитометрија. Со помош на специјални леќи, клетките се анализираат со употреба на расфрлана светлина напред (FSC расејување напред) и странична расфрлана светлина (странично расејување на SSC). Огледалата се користеа за усогласување на светлосните сигнали, така што тие на крајот можеа да ги соберат детектори и да се претворат во сигнали за електричен напон. ОЦЕНУВАЕ ФАКС Користејќи ги мерењата на протокот на цитометријата, Б и Т-клетките, НК-клетките и моноцитите беа испитани на диференциран начин (Слика 6, 7). Сл. 6: Анализирани популации на Б, Т-клетки и моноцити Сл. 7: Анализирани популации на НК-клетки
34 Материјал и методи 23 цитотоксични Т-клетки Слика 10: Претставнички запис на точки на боење на цитотоксични Т-клетки или Т-помошни клетки; цитотоксични Т-клетки (CD8a PE +, CD4 PE-Cy7 -) во горниот лев квадрант; Т-помошни клетки (CD8a PE -, CD4 PE-Cy7 +) во долниот десен квадрант. Слика 11: Претставен запис на точки на моноцитно боење; Моноцити (ЦД4 ПЕ-Ци7 +, ЦД3 АПЦ -) НК-клетки не НК-клетки Слика 12: Претставнички запис на боење на НК-клетки; НК-клетки [CD161a светли (CD161a PE +, CD3 APC -)] во горниот лев квадрант, не-nk клетки [CD161a пригушен (CD161a PE +, CD3 APC -)] во долниот лев квадрант. Слика 13: Порта CD161a PE, минимум на 10 4,1 за НК-клетките (CD3 -/CD161a светла) и 10,2,2 за не-nk клетките (CD3 -/CD161a пригушен)
37 Статистика за материјал и методи Статистичката евалуација беше извршена со помош на софтверот GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, САД). Податоците беа оценети со користење на еднонасочен тест за анализа на варијанса (ANOVA) и последователен тест за повеќекратна споредба на Туки. За да може да се утврдат општите ефекти на диетата и клетките на туморот независно од другиот фактор, беше извршен двонасочен ANOVA тест со последователен тест Bonferroni. Ограничувањето на значењето за двата теста се засноваше на веројатност за грешка од најмногу 5% (П 0,05).
38 Резултати Резултати 3.1 Развој на телесната тежина на испитаните животни Краткорочен тест Просечната телесна тежина на испитаните животни на почетокот на тестот беше 183,54 g во контролната група и 183,76 g во групата DIO. Стаорците кои примиле нормално-калорична диета за контрола во период од шест недели ја зголемиле својата просечна тежина за 58% на 290 ± 2,6 g за ова време. Спротивно на тоа, животните кои примале калорична диета ДИО ја зголемиле својата телесна тежина за 65,5% на просек од 304 ± 3,9 g (Табела 3). Во времето на инјектирање на туморски клетки или носител на NaCl, животните кои се хранат со ДИО постигнале значително поголема телесна тежина во споредба со животните кои добиле контролна диета (П = 0,006), (Слика 16). Таб. 3: Развој на тежината на стаорците за контрола и ДИО во краткорочен експеримент неколку недели по почетокот на диетата Развој на телесната тежина 183,54 ± 1,5 212,37 ± 1,6 238,13 ± 2,3 255,2 ± 2,34 268, 34 ± 2,4 284,16 ± 2,75 290,24 ± 2,62 контрола [g] развој на телесната тежина ДИО [g] 183,76 ± 1,6 227,18 ± 1,79 251,02 ± 2,61 271, 0,05 ± 2,79 283,24 ± 3,46 297,47 ± 3,8 304,11 ± 3,88 Прикажани се средните вредности и соодветната стандардна грешка (± СЕМ); n = 8 стаорци/група
40 Резултати 29 Таб. 4: Развој на тежината на стаорците за контрола и ДИО во долгорочен експеримент неколку недели по почетокот на диетата Контрола на развојот на тежината [g] 195,53 ± 1,81 222,59 ± 2,17 245,93 ± 2,46 259, 45 81 2,81 271,8 ± 2,88 284,29 ± 3,08 294,75 ± 3,02 Развој на телесна тежина ДИО [g] 195,53 ± 2,07 227,28 ± 2,47 253,74 ± 3, 33 269,09 ± 3,68 277,51 ± 4,51 294,16 ± 4,14 304,78 ± 4,43 недели по почетокот на диетата Контрола на зголемување на телесната тежина [g] 302,76 ± 3,48 310,51 ± 3, 68 318,04 ± 3,66 329,58 ± 4,09 328,73 4,38 332,49 ± 4,75 332,9 ± 5,47 Развој на телесната тежина ДИО [g] 312,69 ± 4,98 327, 54 ± 5,90 336,25 ± 6,66 351,76 ± 7,21 352,66 ± 7,34 355,67 ± 7,31 367,84 ± 9,19 Прикажани се средните вредности ± СЕМ; n = 8 стаорци/група. Исцртаната линија при преминот од 10-та до 11-та недела по почетокот на експериментот ја илустрира временската точка на инјектирање на клетките MADB106 или NaCl.
41 Резултати 30 Тежина на телото во g * * * * * * * Контрола на ДИО инјектирање со инјектирање неколку недели по почетокот на диетата Сл. 17: Развој на телесната тежина по 13 недели од хранењето со контролна диета и ДИО диета. Прикажани се средните вредности на тежините на сите тест животни (n = 8), EM SEM. И.в.инјекцијата на туморските клетки или носачот (NaCl) се случи по 10 недели. Времето во кое тежините на групата DIO значително се разликуваат од оние на контролната група се означени со *. 3.2 Концентрации на триглицериди и холестерол во црниот дроб Концентрациите на триглицериди и холестерол во црниот дроб беа исто така значително повисоки кај ДИО стаорците во споредба со контролните животни (Таб. 5). Таб. 5: Тежина на телото, триглицерид и концентрација на холестерол во црниот дроб кај контролирани и ДИО животни во кратки и долгорочни експерименти Краткорочен експеримент Долгорочен експеримент MADB106 инјекција MADB106 инјекција 21 ден по инјектирање MADB106 TG во црниот дроб (μмол/g) Контрола 38 ± 8 38 ± 4 ДИО 90 ± 15 * 65 ± 9 * Холестерол во црниот дроб (μмол/г) Контрола 6,7 ± ± 0,3 ДИО 11,0 ± 1,6 * 9,3 ± 0,8 * прикажано се средствата ± СЕМ; n = 8 стаорци/група; значајни вредности означени со *, Р 0,05; ТГ = триглицериди
42 Резултати од FACS - Мерења во краткорочен експеримент НК-клетки Евалуацијата на бројот на НК-клетките по кратко изложување на туморот во текот на 15 минути покажа значителни разлики помеѓу контролните и ДИО животните. Стаорците кои се хранат со ДИО имале значително помалку НК-клетки од контролните животни (прикажани како% од PBMC) од контролните животни (4,3 ± 0,07 наспроти 3,95 ± 0,38 (СЕМ)% PBMC, Сл. 18) НК клетки (% од PBMC) KoNaCl KoMADB106 * DIONaCl DIOMADB106 Слика 18: Квантитативна проценка на бројот на НК клетки кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и 15 мин по MADB106- Инјекција на туморски клетки (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; значителни разлики помеѓу контролните и ДИО-групите беа означени како *, Р 0,05; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.
43 Резултати Б-лимфоцити По кратка стимулација на туморските клетки од 15 минути, споредбата на бројот на клетките на Б-лимфоцитите не открива значителни разлики помеѓу одделните групи (слика 19). Б лимфоцити (% од PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 19: Квантитативна проценка на Б-лимфоцитите кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и 15 мин по туморските клетки MADB106 -Инекција (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Т-лимфоцити на периферна крв во мононуклеарни клетки По кратка стимулација на туморските клетки од 15 минути, споредбата на бројот на Т-лимфоцитните клетки не открива значителни разлики помеѓу одделните групи (Слика 20). Т-лимфоцити (% од PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 20: Квантитативна проценка на Т-лимфоцити кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и 15 мин по туморските клетки MADB106 -Инекција (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.
44 Резултати Ц-цитотоксични (ЦД8 +) Т-клетки По кратка стимулација на туморските клетки од 15 минути, немаше значителни разлики помеѓу одделните групи во однос на бројот на клетки на Т-клетките на цитотоксичните (ЦД8 +) (Слика 21). 45 Цитотоксични Т-клетки (% од Т-лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 21: Квантитативна проценка на цитотоксични Т-клетки (CD8 +) кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко ) и 15 мин по инјектирањето на туморските клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Помошни клетки на мононуклеарни клетки во периферната крв (ЦД4 +) Немаше значителни разлики помеѓу одделните групи при споредување на бројот на Т-помошни клетки (ЦД4 + Т-лимфоцити) по кратка стимулација на туморските клетки од 15 минути (слика 22) ) Слика 22 помошни клетки (% од Т-лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 22: Квантитативна проценка на Т-помошни клетки (ЦД4 +) кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и 15 мин по инјектирање на тумор-клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.
45 Резултати Моноцити Имаше значителни разлики при споредување на бројот на моноцитни клетки на контролирани животни со нормална тежина и дебели на кои им беше инјектиран NaCl. Во споредба со контролираните дебели животни, животните со нормална телесна тежина имале значително поголем број на моноцити, засновани на PBMC во периферната крв. Споредбата на животни со нормална тежина и дебели тумори, како и споредбата на ДИО и контролните групи, не откриваат значителни разлики (Слика 23). Моноцити (% од PBMC) KoNaCl * DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 23: Квантитативна проценка на моноцити кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и 15 мин по инјектирање на клетките на туморот MADB106 ( MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; значителни разлики помеѓу групите означени со *, П 0,05; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.
46 Резултати од FACS - мерења во долгорочен експеримент НК-клетки При споредување на процентот на НК-клетки во PBMC три недели по инјекцијата MADB106, немаше значителни разлики помеѓу одделните групи (Слика 24). Слика 24: Квантитативна проценка на бројот на НК-клетки кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и три недели по бројот на клетките на туморот MADB106 Инјекција (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Лимфоцити на периферна крвна мононуклеарна клетка Б Дури и три недели по инјекцијата на клетките MADB106, проценката на бројот на клетките на Б-лимфоцитите не открива релевантни разлики помеѓу одделните групи (слика 25). Б-лимфоцити (% од PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 25: Квантитативна проценка на Б-лимфоцитите кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (DIO) или контролна диета (Ko) и три недели по MADB106 туморските клетки -Инекција (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.
47 Резултати Т-лимфоцити Три недели по инјектирањето на клетките на туморот, немаше значителни разлики помеѓу одделните групи во однос на процентот на Т-лимфоцити во PBMC (Сл. 26). Т-лимфоцити (% од PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 26: Квантитативна проценка на Т-лимфоцитите кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (DIO) или контролна диета (Ko) и три недели по MADB106 туморските клетки -Инекција (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Цитотоксични мононуклеарни клетки на периферната крв (ЦД8 +) Т-клетки Проценката на бројот на клетките на цитотоксичните (ЦД8 +) Т-клетки по 3 недели од растот на туморот не откри значителни разлики помеѓу одделните групи (слика 27). 45 Цитотоксични Т-клетки (% од Т-лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 27: Квантитативна проценка на цитотоксични Т-клетки (CD8 +) кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко ) и три недели по инјектирањето на туморските клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.
48 Резултати Т-помошни клетки (ЦД4 +) Споредбата на бројот на клетки на Т-помошните клетки (ЦД4 +) по 3 недели од растот на туморот не открива релевантни разлики помеѓу одделните групи (Слика 28). 70 Т-помошни клетки (% од Т-лимфоцитите) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 28: Квантитативна проценка на Т-помошните клетки (ЦД4 +) кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и три недели по инјектирањето на туморските клетки MADB106 (MADB106) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Моноцити на периферните крвни мононуклеарни клетки По 3 недели раст на туморот, споредбата на бројот на моноцити не открива значителни разлики помеѓу одделните групи (Слика 29). Моноцити (% од PBMC) KoNaCl DIONaCl KoMADB106 DIOMADB106 Слика 29: Квантитативна проценка на моноцити кај машки стаорци F344 кои се хранат со дебелина предизвикана од диета (ДИО) или контролна диета (Ко) и три недели по инјектирањето на туморските клетки MADB106 (MADB106) ) или NaCl (n = 8); прикажани се средните вредности ± SEM; PBMC = Мононуклеарна клетка на периферната крв.