Тандем течна хроматографија; Пристап заснован на масовна спектрометрија за анализа на метаболит на

Резиме

Овде опишуваме протокол за екстракција на метаболити од Staphylococcus aureus и нивна последователна анализа со употреба на течна хроматографија и масовна спектрометрија.

Апстракт

Вовед

Бактериските патогени се соочуваат со многу предизвици во средината на домаќинот. Покрај директниот напад на имуните клетки, домаќинот лачи и хранливи материи важни за преживување и репликација на бактериите, генерирајќи имунитет на исхраната 1, 2. За да преживеат овие непријателски средини, бактериските патогени имплементираат фактори на вирулентност. Некои од овие фактори може да се користат за да се избегне имунолошкиот одговор на бактериите; Други фактори се дигестивни ензими како хијалуронидаза, термонуклеаза и липаза кои им овозможуваат на бактериите да ги надополнуваат хранливите материи што недостасуваат од компонентите 3, 4, 5 добиени од ткиво. Навистина, бактериите развија регулаторни системи кои ја врзуваат физиолошката состојба на клетката со производството на фактори на вирулентност 6, 7, до> 8, 9, 10.

Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

Протокол

1. Подготовка на тампонски раствори

  1. Подгответе солен раствор на фосфат (PBS; pH 7,4) со разредување на раствор од 10 × PBS до крајна концентрација од 1x со ултрачиста вода (дестилирана и деонизирана) вода.
  2. Подгответе раствор за гаснење со комбинирање на 2 ml ацетонитрил, 2 ml метанол, 1 ml ултрачист H 2 O и 19 μl (0,1 мм конечна концентрација) мравја киселина.
  3. Подгответе LC-MS растворувач А со додавање на мравја киселина (0,2% [v/v] крајна концентрација) во ултрачиста вода.
  4. Подгответе LC-MS растворувач Б со додавање на мравја киселина (0,2% [v/v] крајна концентрација) во ацетонитрил.
    ЗАБЕЛЕШКА: Сите раствори треба да се направат со највисоки достапни реагенси за чистота (обично со висока течност во хроматографија со високи перформанси). Растворите треба да бидат свежо подготвени пред секој експеримент и да се чуваат на мраз пред употреба.

2. Воспоставување на раст на S. aureus во стабилна состојба

  1. Streak S. aureus соеви од интерес за изолација на триптичен соја агар (TSA) од замрзнат раствор на глицерол. Инкубирајте на 37 ° C 16-24 часа.
  2. Инокулирајте 4 ml супа од соптичка соја (TSB) или друг соодветен медиум во стерилни стаклени цевки за инкубација со одделни колонии на секој вид. Инкубираат наклонети (

Агол од 70 °) со ротација на 60 вртежи во минута (вртежи во минута) на 37 ° C за 16-20 часа.
ЗАБЕЛЕШКА: Културите преку ноќ се склони кон градиент на кислород ако стандардните процедури, вклучително и оние опишани во чекор 2.2, влијаат на клеточната физиологија. Значи, ние користиме повеќекратна стратегија за разредување на грбот за да обезбедиме биолошка стабилна состојба (види чекори 2.4-3.2, подолу).

  • Користете спектрофотометар за да ја измерите оптичката густина на културите од чекор 2.2 на 600 nm (OD 600). Користете стерилен медиум како оптичка референца (празен). Овие клетки се разредуваат до OD 600 од 0,05 во 50 ml стерилен медиум TSB (загреан до 37 ° C) во одделни шишиња DeLong од 250 ml.
  • Инкубирајте ги културите на 37 ° C во водена бања со 280 вртежи во минута со тресење.
  • На секои 30 мин, направете мерења на ОД 600; како што се зголемуваат оптичките густини, може да биде потребно разредување на културите со TSB така што тие да останат во рамките на линеарниот опсег на апсорпција на спектрометарот.
  • Ако културите од чекор 2.5 имаат ОД 600 од

    Достигнете 0,8-1,0, субкултурете ги во 50 ml 37 ° C на TSB до OD600 од 0,01-0,05 и повторете ги чекорите 2,4 и 2,5.

    0,4-0,5, користете серолошка пипета за да отстраните 13 ml култура од колбата и да го нанесете примерокот на филтрите.

  • Откако ќе се филтрира целиот примерок, веднаш измијте го филтерот со ≥ 5 ml ладно-ладно PBS-метаболити поврзани со.
  • Ослободете го вакуумот и користете пар стерилни форцепси за да го отстраните филтерот од прженицата. Превртете го филтерот (од страната на ќелијата надолу) во претходно ладениот раствор за гаснење.
    ЗАБЕЛЕШКА: Важно е да се извршат горенаведените чекори брзо (т.е. во рок од неколку секунди) и колку што е можно побрзо да се обезбеди спречување на течноста во клетките, при што се запира метаболичката активност.
  • Инкубирајте ги филтрите во растворот за гаснење на сув мраз за 20 мин.
  • Користете стерилни форцепс, превртете ги филтрите (од ќелијата одгоре) во садот Петри и користете микропипета за да ги изгаснете клетките во растворот за гаснење за да ја исплакнете мембраната.
  • повторно суспендирајте ги клетките во раствор за гаснење и потоа пренесете ја клеточната суспензија во стерилна цевка отпорна на удар од 2 ml

    100 μ L од 0,1 мм силициумски мониста. Чувајте го на сув мраз или на -80 ° C.

    1. Одмрзнете ги примероците на влажен мраз и ставете ги клетките во хомогенизатор со четири рафали за 30 секунди на 6.000 вртежи во минута, со 2 мин. Периоди на ладење на сув мраз се мешаат со циклусите.
    2. Разјаснете ги листите 15 минути во претходно ладен, ладен микроцентрифуга со максимална брзина (т.е. 18,213 xg на ≤4 ° C).
    3. Пренесете го супернантот во чиста цевка за реакција.
    4. Користејќи микропипета, пренесете мал дел од примерокот во цевка за микроцентрифуга за квантитација на преостанатата содржина на пептид во чекор 6; Зачувајте го остатокот на -80 ° C.
      ЗАБЕЛЕШКА: Волуменот на резервираниот примерок ќе варира во зависност од анализата на BCA во чекор 6.1. Овој примерок треба да се чува на влажен мраз за непосредна анализа или да се замрзне на -80 ° C.

    6. Анализа на бицинхонинска киселина (BCA)

    1. Изведете анализа на BCA, како што е препорачано од производителот на комплетот, користејќи примероци од чекор 5.4 за да се утврди преостанатата концентрација на пептид за секој примерок.

    8. Серија корекција на бројот на јони

    1. Назначете го секој примерок да служи како референтен примерок за корекција на серија (на пример, див тип, реплицирајте 1).
    2. Пресметајте го збирот на бројот на јони за сите метаболити во референтниот примерок. Повторете ја оваа пресметка за сите примероци.
    3. Поделете го вкупниот јонски број на секој примерок со вкупниот јонски број на референтниот примерок за да создадете сооднос.
    4. Поделете го јонскиот број за секој метаболит во примерок со соодносот примерок/референца за да добиете многу коригиран јонски број за секој метаболит.

    1. Поделете ги поправените броеви на јони за секој примерок добиен во чекор 8 со концентрацијата на пептид утврдена со анализата на BCA во чекор 6 за да се добие нормализирана вредност за секој метаболит.
      ЗАБЕЛЕШКА: Нормализираниот, серија-коригиран број на јони за секој метаболит во чекор 9.1 може да се спореди директно помеѓу соевите и статистичката анализа (на пример, тест на Ман-Витни У). Алтернативно познато дека метаболит може да биде непроменет или со третман или генетска позадина може да се користи како уред за нормализација за да открие промени со распаѓање на метаболит. Вклучувањето на позната количина на L-норвалин или глураринска киселина во тампонот за екстракција може да се користи за да се поправи загубата при обработка на примерокот 34.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Резултати од репрезентацијата

    Ние ги анализиравме интрацелуларните метаболички производи на базенот во S. aureus за време на ин витро раст во богат комплексен медиум. Како доказ за принципот, ги споредивме профилите на метаболит помеѓу остеомиелитисот осетлив на метицилин S. aureus изолиран UAMS-1 (див тип [WT]) и изогенски сој на кој му недостасува глобалниот регулатор на транскрипција CodY (Δ codY) 26. Стабилна состојба, експоненцијални култури на WT и codY соеви беа воспоставени во медиум TSB како што е опишано во чекор 2 од протоколот. Однесувањето за раст на култури од див тип и мутантен codY-нула беше слично, со само мали разлики во приносот и стапката на раст (Илустрација 1). Користејќи RNA-Seq и технологија на микроелементи, ние и другите гени одговорни за ензимите вклучени во биосинтезата на аминокиселините добиени од аспартатот беа депресирани во мутираниот c-null codY во споредба со WT клетките за време на - витро - раст на TSB (Слика 2) 25, 27, 30. Покрај тоа, 30, 35 и brnQ1 brnQ2, пермеазите за аминокиселини со разгранет ланец, се преекспресирани во codY нула мутант.

    За да се утврди степенот до кој интрацелуларното изобилство на метаболити во стабилна состојба е поврзано со овој пат променет во нултата мутација, ние правиме профилирање на метаболит заснован на LC-MS. WT и codY-нулите мутациони клетки се одгледуваат во биолошка стабилна состојба и се скенираат како што е опишано во чекор 4 од протоколот. Ние утврдивме изобилство на метаболит преку интензитетот на јони во врвната област за секоја хроматографски разрешена интеграција на метаболит користејќи аналитички софтверски пакет (види Предлог-материјал). Ние ги коригиравме разликите во биомасата нормализирана со изобилство на метаболити на преостанатата концентрација на пептид на секој примерок. Ние исто така ги коригиравме овие вредности за можни серија ефекти помеѓу примероците во секој примерок за сите метаболити, за да го пресметаме просечниот јонски број и да го користиме примерокот од див тип како референтна вредност. Овој пристап овозможи меѓу-примерочни споредби на изобилството на метаболити во услови. Интербаболитната споредба во рамките на даден примерок може да се постигне на сличен начин со прво нормализирање на изобилството на метаболит од бројот на јони со употреба на методот на стандардни моларни количини на додавање.

    Ние го споредивме нивото на клучните посредници во аспартатната патека во УАМС-1 и неговиот codY-нула мутант. Како во 3 Како што може да се види, крајните производи на оваа патека (на пример, треонин и (изо) -леуцин) изобилуваат во codY - нула мутантни клетки, додека претходниците (на пр. Аспартат и оцетил хомосерин) изобилуваат во WT клетките. Комбинираната регулација на BrnQ пермеаза 36 и биосинтетичката патека на ILV веројатно доведува до зголемување на изолеуцинот и леуцинот 30. Иако разликите се релативно мали (29 утврдени со анализа на RNA-Seq, исто така треба да се забележи. DHP, 2,6-диаминохепетанеоат ( 2,6-диаминопимелат).

    хроматографија
    Слика 3: Фреквенции на метаболити во аспартатот - Семејството се менува во codY мутант. Прикажани се 2-пати промените на избраните метаболити во codY нултата мутација во споредба со UAMS-1 (WT). Промената беше одредена со делење на просечната фреквенција на три реплика на codY-нула биолошки сој со просечното изобилство на три биолошки репликати на WT сојот. Потребна е претплата за стандардна грешка помеѓу биолошките повторувања за секој метаболит. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Дискусија

    1,0, разредена назад до ОД 600 од

    0,05, одгледувани и собрани кога имаат 600 ОД

    Достигна 0,5. Таквата постапка ги разредува и цитоплазматските молекули, вклучително и стабилните РНК, додека се акумулира раст преку ноќ. Навистина RNAIII, ефектот на системот за осетливост на агрор, е една од таквите РНК и го регулира изразувањето на некои исти гени цели како CodY 25, 43, 44. Кумулативната RNAIII може да ја прикрие регулацијата зависна од CodY, што доведува до потценување на јачината на Репресија или стимулација од CodY (Шарма и Бринсмајд, необјавени резултати).

    Едно ограничување на оваа анализа е тоа што обезбедува моментален увид во изобилството на метаболички производи во ќелијата; не можат да се извлечат заклучоци од резултатите во врска со промените во протокот низ одредена патека. На пример, изобилството на лизин и метионин помеѓу двата испитани сорта не може да се промени, и покрај депресијата на биосинтетските ензими во codY-нула истегнување (2 и 3). CodY-нултата сорта всушност може да произведе повеќе лизин и метионин, но тие можат брзо да се претворат во други соединенија; така што овие молекули не се акумулираат. Користење на 13 C или 15 N означени извори на јаглерод или азот ќе ни овозможи да ги следиме скелетите на јаглерод и азот низ главните метаболички коридори 45, 46.

    Ние ја искористивме процедурата опишана за да ги објасниме промените во метаболитните базени кај S. aureus, B. subtilis 29, Mycobacterium tuberculosis 47 и Enterococcus faecium 48, сепак постапката може да се примени и на други Грам-позитивни и Грам-негативни бактерии, вклучувајќи и други човечки патогени лесно се одгледува во лабораторија. Навистина, неочекуваните врски помеѓу метаболизмот и вируленцијата можат да покажат метаболомска и транскриптомска интеграција на информации што може да доведат до нови стратегии за лекување на инфекции.

    Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.

    Откривање

    Авторите наведуваат дека немаат финансиски интереси.