11-21% јаглехидрати 01% маснотии 0,1 2% протеини

Примена на мембрански адсорбери и системи за скрининг за насочена обработка на компирните протеини Томас Шепер, Ален Граф, С.Бутел, М.Лотц, Р. Улбер Лајбниц Универзитет Хановер Калинстр. 3 30167 Хановер Германија 1

Важноста на компирот Околу 220 диви видови и околу 2000 сорти познати ширум светот денес Светски берат околу 300 милиони т годишно во 2004 година во ЕУ 2,7 милиони хектари обработлива површина; Принос 65 милиони т Прибл. 30% скроб компир (25-30 различни сорти) Операција на кампањата (компир од јуни до септември; скроб компир од август до јануари)

Состојки на компир од скроб 11-21% јаглени хидрати 01% маснотии 0,1 2% протеини 2% влакна 72% вода амино киселини, витамини и минерали вода 72% компири амино киселини 2% скроб 20% протеини 2% други состојки 2% влакна 2% 3

Индустриско производство на скроб (Емсландски скроб) Компири Компир Перење Ренде Декантер Обратна осмоза Скроб и влакна Високо протеински секундарен проток Сепаратор (миење на скроб) Компирско овошје вода (KFW) Скроб 4

Додадена вредност на компир протеин Приближно 6 милиони тони KFW во Европа Вода 94% Компир вода овошје Амино киселини 2% Други компоненти 2% Во однос на бројките, околу 120.000 тони компир протеин Скроб 0,5% протеини 2% Состав на протеини KFW: 40% пататин (главен гликопротеин ) 50% инхибитори на протеаза (мали протеини) 10% протеини со висока молекуларна тежина (полифенол оксидази, кинази, фосфорилази) 5

Гликопротеини на пататин кои се состојат од 362 аминокиселини (богати со лизин и тирозин) MW = 40-44 kda, pi = 4,5-5,2 (изоформи со различни модели на гликозилација) Ензимски активности: активност на липид трансфераза, активност на липидна ацил хидролаза, активност на естераза, Озборн и Кембел, Ј. Ам. Хем. 1986, 18, 575 Jacusen and Foote, J. Food Biochem. 1980, 4, 43 6

Група на инхибитори на протеини (PI) Хетерогена класа на топлински стабилни протеини богати со цистеин MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0 90 Играат улога во одбраната на растението од штетници и сл. Инхибитивно дејство врз серинската и цистеинската протеаза Промовирајте чувство на ситост (Инхибитор на протеаза II) Можен антиканцероген ефект 7 Кенеди и сор., Фармакол. Има. 1998, 78, 167-209. Pouvreau et al., J. Agri and Food Chem 2001, 49 (6), 2864 Hill et al., Physiol and Behav. 1990, 48, 241 година

Употреба на фракции на протеини од компир Nutraceuticals Бебе и специјална храна Спортска исхрана (Амино маса) Маркетинг како апетит (Satise) Медицинска употреба Третман на дијабетес II и рак на кожа

Nutraceuticals Храна со позитивен физиолошки ефект Борба против болести/превенција, како и зголемување на перформансите/благосостојба Во споредба со растот на целокупниот пазар на храна (1-3% годишно), обемот на пазарот на нутриционистички производи расте за околу 8% на годишно ниво (проценет светски пазар 12 милијарди евра ) Барања: вкус добро, бидете практични, лесно разбирлив ефект, ефтин, изгледајте добро 9

Вредност за создавање на протеин од компир KFW Топлинска коагулација на протеините KFW обезбедува денатуриран производ Најсовремена врнежи на протеини 110 С Без биоактивност Маркетинг со низок квалитет на добиточна храна Денурализирана цена на компир протеин по кг како протеин од компир Храна за добиток: 0,5 до 1 едноставен додаток на храна: 4 до 6 Процес на мембрана за апсорпција на визија KFW фракционирана изолација на протеини од компир (природен) на биоактивни протеински фракции (природен) маркетинг како високо квалитетни функционални состојки проценета продажна цена за кг: приближно 50 10

протеинска мешавина (протеините се врзуваат според изоелектричната точка) - -SO - 3 OS- 3 - -SO 3 - OS- 3 - -SO 3 - OS-3 профил преку големината на порите во мембраната: околу 3,0 μm дебелина на мембраната: 180-200 μm рамен модул (аналитички цели) спирален модул (протеин низводно) вертикален проток на површината на мембраната вертикален проток на површината на мембраната

Разновидност на лиганди низводно материјал (катјонски c групи, 2+ 2+ антитела, Ni, Cu) Основен материјал (мембрана, мониста) низводно услови (на пр. Електрично поле) врзувачка хемија (алдехид, епоксид)

целни имуноглобулини на протеински лиганд рт-па, р-гх глик. протеини стрептавидин His-tag-протеини плазмиди, протеини протеин А антитело конканавалин А биотин Cu, Ni аптамери

Плоча поставена од ленти со 8 бунари

Вметнување на интелигентен скрининг примерок

катјонски разменувач анјонски разменувач протеин A Антитело со негов обем Con A

додаток на примерок на мембрана за фаќање

примерок на катјонски разменувач 6 примерок на анјонски разменувач 4 протеин примерок 11 примерок His-tag 3 примерок на антитела 10 Con примерок 1

01 0,1 02 0,2 03 0,3 04 0,4 05 0,5 06 0,6 07 0,7 08 0,8 09 0,9 10 1,0 11 1,1 12 1,2 катјонски разменувач примерок од анјонски разменувач 6 примерок 4 протеин Примерок 11 His-tag примерок 3 примерок од антитела 10 Con примерок 1 градиент на натриум хлорид

Апсорбер за зголемување на скалата мембрана Едноставно зголемување на скалата Различни геометрии и режими на работа Спин модули (1,9 7,5 см 2) До 2 мг протеини/см 2 Сартобинд модули (15, 75, 100 см 2) До 0,8 мг протеин/см 2 24 Sartobind MultiSep-ModuleModule (0,1 80 м 2) До 0,8 мг протеин/см 2

Разделување на протеини со помош на мембрански адсорбери Употреба на анјонски (Q) и мембрански модули на катјонски разменувач (S) (сартобинд 15-100 см 2) Тампон А Буфер Б вентил за вбризгување на пумпа LC пумпа мешање на ќелии примерок мембрански модул Детектор на УВ детектор на фракции на спроводливост 25

Резултати на лабораториска размерка Q дел: Пататтин S дел: Парина протеин 2,00 1,0 1,75 100 0,9 100 1,50 80 0,8 80 AU [280 nm] 1,25 1,00 0,75 60 40 елуент во% AU [280 nm] 0,7 0,6 0,5 0,4 60 40 елуент во% 0,50 20 0,3 20 0,25 0 0,2 0 0,00 0 5 10 15 20 25 30 35 Време t во [мин] 0,1 0 5 10 15 20 Време t во [мин] Профил на вчитување и елуцијација на модул Q15 Профил на елузија на модул S15 26

Резултати на лабораториска скала Процесни чекори Еквилибрирање на мембранскиот модул со 50 mm NaPP (ph 7) Вчитување со KFW (разреден 1: 5, ph 6,5) Исплакнување со 50 mm NaPP (ph 7) Елузија со 0,5 M NaCl раствор Регенерација на мембраната со Волумен на полнење на раствор од 1M NaCl 0,7 L/m² капацитети на врзување на областа на мембраната S adsorber: 0,67 mg/cm/Q adsorber: 0,23 mg/cm² 27

Раздвојување на протеините со помош на мембрански апсорбер SDS-PAGE (Tris-HCL, 18%, боење со Coomassie) Патека 1: Маркер со молекуларна тежина lk Патека 2: вода од овошје од компир разредена 1:10 лента 3 и 4: Елукционен дел (0,5 М NaCl, Q 15) Патека 5: Измијте дел 6: Елукција фракција (0,5 М NaCl, S 15) 28

Карактеризација на Q-фракцијата - MALDI-MSMS 29

Карактеризација на фракцијата S - MALDI-MSMS 4153 7879 7857 Супресант на апетит: SATISE S дел Kunitz инхибитор KI Bowman Birk инхибитор BBI карбоксипептидаза инхибитор CPI 20305 100 4271 интензитет [%] релативна Int 80 60 40 20 4144 3890 4292 8058 10101 20227 S дел KI BBI CPI 0 потиснувач на апетит 5000 10000 15000 20000 25000 маса (m/z) 30

Нагоре-скалирање на процесната скала Sartobind модули (15, 75, 100 cm 2) Sartobind MultiSep модули (6600 cm 2) 31

Иновативна мембрана низводно процес KFW основно разјаснување/цврсти материи на микрофилтрација (протеини, скроб, влакна и сл.) Мембранска адсорпција депротеинизиран KFW (Q) - мембранска адсорпција 6600cm² (S) мембрана адсорпција 6600cm² депротеинизиран KFW елуат елуат раствор на сол ултра/диафилтрација Задржи лиофилизација/сушење со прскање лиофилизација/сушење со спреј инхибитори на пататин протеаза xx.xx.2007 32

Резултати од процесот на скалата на процесот чекор V [L] t [мин] P [лента] Еквилибрација 5 32 3.2 20 2.0 (20 mm NaPP, ph 7) KFW оптоварување 10 5.6 2.2 (микрофилтриран, 1: 5 разредена, ph 6,5) Плакнење (20 mm NaPP, ph 7) 10 4,2 2.2 Елузија Q модул 7,5 3,0 0,8 (0,5 M NaCl) Елукција S модул 6,0 Регенерација на мембраната 2,3 1,0 (0,5 M NaCl) (1 M NaCl) 5,0 2,0 0,8 Капацитет на врзување на S-адсорбер: 1,00 mg/cm² (мал: 0,67 mg/cm 2), Q апсорбер: 0,37 mg/cm² (мал: 0,23 mg/cm 2) 33

Мембраната од 1м 2 се користи за добивање (може да се постигне врзување и елуирање на 80% од протеините содржани во KFW): - 3,7 g пататин - 10 g инхибитори на протеаза - ова трае 20-25 минути, што е зголемување областа на мембраната не доведува до зголемување на времето. Користете KFW 1: 5 разредени 5 L на 1 m 2 xx.xx.2007 година 34

Електрофореза на гел и капилари Анализа на производот Фракции на миење Фракции на елукција Au (214 nm) S дел Q дел f kda 100 85 70 60 50 40 30 KFW Q мембрана S мембрана 25 20 0 5 10 15 20 25 Време на миграција [мин] Анализи на ензимска активност 15 M пататин (Липидна ацилна хидролаза) тест за пататин Определување на активност на инхибитор на протеаза против анализи на активност на трипсин Полифенол оксидаза l itä 35 PI

Нарушувачки компоненти: Гликоалкалоидите главно се наоѓаат во кора од компир и микроби 20-2525 mg/100g свеж производ како токсичен праг Симптоми: болки во грлото, гадење/повраќање, дијареја, грчеви во стомакот и цревата, главоболка, треска, отежнато дишење, вртоглавица, губење на свеста Д-галактоза N D- Гликоза N HO HO OH L-глукоза O β O OH OH O β β OO HO α O CH 3 OH OH L-рамноза α-соланин: MW 868,08 g/mol H 3 C HO HO O L-рамноза α O HO OH OH OO α HO β OO CH 3 OH OH L-рамноза α-хаконин: MW 852,08 g/mol 36 Maga; Критик Rev. Food Sci Nutr 1980; Ли, 12 (4), 371 и сор. J Agric Food Chem. 2004; 52 (10), 2832 година

HPLC анализа на гликоалкалоид Екстракција на компир (фракции) оцетна киселина Прочистување на цврста фаза Анализа на HPLC Резултат 0,15 Соланин стандард Стандард на хаконин Екстракт од протеин од компир AU (200 nm m) 0,10 0,05 Лакон на хаконин So 000 0,00-0, 05 0 5 10 15 20 25 30 35 време на задржување [мин] Квантитативно определување на гликоалкалоид до 20 ppm, фракциите добиени преку мембрански апсорбер се ослободени од алкалоид ! 37

Заклучок Овошната вода од компир содржи големи количини на биолошки вредни протеини. Протеините досега се добиваат денатурирани со коагулација на топлина (добиток) со користење на иновативен процес на мембрана, протеините можат нежно да се фракционираат и изолираат во биоактивна форма. Висока додадена вредност на индустриски отпад (KFW) пренесување од лабораториска скала во можна е индустриска скала 38

Индустриско производство на скроб и протеини Компири Перење компири Ренде Распрскувачи Обратна осмоза Скроб и влакнести материјали KFW Сепаратор (миење на скроб) Иновативен процес на мембрана Протеински врнежи 110 C Скроб фракциониран компир протеин (природен) Денатуриран компир протеин xx.xx.2007 39

Производство на протеини овошна вода од компир Мембрана низводно процес Мајчин биоактивен протеински фракции Пататин инхибитор на фракција на протеини Активности на ензимите: активност на липид трансфераза активност на естераза на липидна ацил хидролаза MW = 40-44 44 kda, pi = 4,5-5,2 5,2 xx.xx.2007 41 Инхибирачки ефект врз серинската и цистеинската протеаза MW = 4-23 kda; pi = 5,1-9,0

Преглед на протеинските фракции Пропорција на протеини [%] Моларна маса [kda] Patatin ti 38 40 (80) Инхибитор на компир I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Инхибитор на компир II (PI-2) 22 10, 2 (21) Инхибитор на аспартил протеаза на компир (PAPI) 6 19.9-22 Инхибитор на компир цистенил протеаза (PCPI) 12 20.1-22.8 Инхибитор на протеаза на компир куниц (PKPI) 4 20.22 Други инхибитори на серин протеаза (OSPI) ) 1,5 21-21,8 Инхибитор на карбоксипетидаза од компир (PCPI) 1 4.3 Полифенолоксидази (ППО) без инфо 60; 69 Изоензими на фосфорилаза без инфо 180-600 Скробни синтези без инфо 140 Протеински кинази без инфо без информации Лектин 1 65,5 хх.хх.2007

Обновливи суровини Земјоделски и шумарски производи произведени производи што се користат во непрехранбениот сектор (особено за производство на биоенергија) Земјоделски остатоци Сурутка (преработка на млеко) Меласа (преработка на шеќерна репка) Овошна вода од компир (производство на скроб) Улбер; CIT 2005, 77 No4, 363 xx.xx.2007 година 43

Компиров скроб Годишно производство во ЕУ 9,1 Скроб компир Миот има содржина на скроб до 21% (трпезарен компир околу 15%) Ориз прибл. 70-7575%, пченица 58-64%, пченка 60-70% Скроб се состои од 20% амилоза и 80% амилопектин Извор: Здружение на индустријата за скроб xx.xx.2007 година 44

Индустриско производство на скроб (Емсландски скроб) Компир Компир Перење ренде Декантер Обратна осмоза Скроб и влакна Високо протеински секундарен проток Сепаратор (миење на скроб) Овошна вода од компир (KFW) Скроб xx.xx.2007 45

Употреба на скроб Технички производи (хартија, лепила, градежни материјали, текстил) 50% козметички производи се преработуваат во секторот за храна денес xx.xx.2007 46

Група инхибитори на протеаза Протеин Пропорција на протеин KFW [%] Моларна маса [kda] Инхибитор на компир I (PI-1) 4,5 7,7-7,9 (39) Инхибитор на компир II (PI-2) 22 10, 2 (21) Инхибитор на аспартил протеаза на компир (PAPI) 6 19.9-22 Инхибитор на цистеинил протеаза на компир (PCPI) 12 20.1-22.8 Инхибитор на протеаза на компир куниц (PKPI) 4 20.2 Други инхибитори на серин протеаза (OSPI) 15 1.5 21-21.8 Инхибитор на компир карбоксипетидаза (PCPI) 1 4.3 47

Квалитет на протеинот од компир Висок квалитет на хранлива вредност: 120 ограничувачки: Триптофан 100 макс. Аминокиселинска оценка (AAS) 80 чисто растително 60 висок процент на глутамин или g протеин] Анфо [mg/g 40 FAO/WHO стандарден компир протеин Emsland скроб 20 0 FAO/WHO- Препорака (1990): Поправена дигестибилност на протеините AAS = AAS x вистинска сварливост на фецесот Ile Leu Lys Met + Cys Tyr Thr Trp Val Протеин со биолошка важност за варење [%] AAS PDCAAS FAO/WHO/UNU Expert Expert (1985), Барања за енергија и протеини, Технички извештај Серија 724. Светска здравствена организација, vaенево говедско месо 80 98 0,94 0,92 јајце 100 98 100 1,00 100 1,00 извештај серија 724. кравјо млеко на светот 91 95 1,00 1,00 соја 74 95 0,96 0,91 пченица 64 91 0,47 0,42 компир t 69-100 1,00 - Schaafsma, G. (2000), Резултат на аминокиселина корегирана за сварливоста на протеините. Весник за исхрана 130, 1865-1867 48

Карактеризација на Q група - MALDI MSMS амино киселинска секвенца: 1 MATTKSFLIL FFMILATTSS TCAKLEEMVT VLSIDGGGIK GIIPAIILEF 51 LEGQLQEVDN NKDARLADYF DVIGGTSTGG LLTAMITTPN ENNRPFAAAK 101 DIVPFYFEHG PHIFNYSGSI LGPMYDGKYL LQVLQEKLGE TRVHQALTEV 151 AISSFDIKTN KPVIFTKSNL AKSPELDAKM YDICYSTAAA PIYFPPHHFV 201 THTSNGARYE FNLVDGAVAT VGDPALLSLS VATRLAQEDP AFSSIKSLDY 251 KQMLLLSLGT GTNSEFDKTY TAEEAAKWGP LRWMLAIQQM TNAASSYMTD 301 YYISTVFQAR HSQNNYLRVQ ENALNGTTTE MDDASEANME LLVQVGETLL 351 KKPVSKDSPE TYEEALKRFA KLLSDRKKLR ANKASH Триптичното варење обезбедува пептидни маси што одговараат на теоретското варење Јасна идентификација на пататин преку споредба на базата на податоци xx.xx.2007 49

Карактеризација на фракцијата S - интензитет на MALDI-MSMS [%] 100 80 60 40 S 75 дел

Инхибитор на 4300 Да Куниц (приближно 20 kda) Инхибитор на карбоксипептидаза (прибл. 4300 Да) S 75 дел

20305 Да 20 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 m/z xx.xx.2007 година 50

катјонски разменувач анјонски разменувач протеин A Антитело со негов обем Con A

додаток на примерок на мембрана за фаќање

Плоча поставена од ленти со 8 бунари

Предности на технологијата на мембраната Високи перформанси на раздвојување и капацитет Можни услови на лесна постапка Конвективен пренос на материјал, минимизирано ограничување на дифузијата Голема пропусност, намалено време на обработка 62