Акутна мозочна траума кај глувци проследена со надолжен протокол за сликање со два фотони (во превод на
Резиме
Акутната траума на мозокот е сериозна повреда која до сега не добила соодветен третман. Мултифотонска микроскопија овозможува надолжно проучување на процесот на развој на акутна мозочна траума и истражување на терапевтски стратегии кај глодарите. Два модели на акутна мозочна траума, проучени со употреба на in vivo слика на два-фотона на мозокот, се прикажани во овој протокол.
Апстракт
Вовед
Акутната повреда на мозокот е значаен јавен здравствен проблем со голема инциденца на повреди во сообраќајни несреќи, падови или грабежи и голема преваленца на хронична попреченост во последиците. Терапевтските пристапи за лекување на повреди на мозокот остануваат целосно симптоматски, а со тоа се ограничува ефективноста на прет-клиничката, хируршката и критичката нега. Ова ги прави социјалните и економските ефекти од оштетување на мозокот особено сериозни. Од различни причини, повеќето клинички студии не успеаја да демонстрираат подобрување на закрепнувањето по оштетување на мозокот користејќи нови терапевтски пристапи.
Modelsивотинските модели се клучни за развој на нови терапевтски стратегии за фаза во која се предвидува ефикасност на лекот кај пациенти со повреди на мозокот. Во моментов постојат неколку утврдени животински модели на повреди на главата, вклучително и контролиран удар на кортикалот, повреда на течни удари 2, динамична кортикална деформација 3, пад на тежината 4 и повреди на фотографијата. Голем број експериментални модели се користат за проучување на одредени морфолошки, молекуларни и однесувањето аспекти на патологија поврзана со траума на главата. Сепак, ниту еден животински модел не е целосно успешен во потврдувањето на новите терапевтски стратегии. Развој на сигурни, репродуктивни и контролирани животински модели на повреди на мозокот е неопходен за да се проценат сложените патолошки процеси.
Тука предлагаме да го проучиме методот на стереотактичко боцкање со игла од шприц, што може да се комбинира со истовремена примена на локални лекови, како напреден модел за локална повреда на мозокот и како алатка за проучување на патофизиолошките последици од акутната траума во мозокот на цицачите in vivo.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Протокол
Сите презентирани процедури овде беа спроведени во согласност со локалните упатства за нега на животните (Финскиот закон за експерименти врз животни 62/2006). Дозвола за животни (ESAVI/2857/04.10.03/2012) е добиена од локалната власт (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Возрасни глувци, на возраст од 1-3 месеци, со тежина од 24-38 g, биле чувани во индивидуални кафези во овластениот универзитетски објект за животни и обезбедени им храна и вода ad libitum.
1. Сликање на повреди на мозок преку прозорец на мозок
2. Сликање на повреди на мозок преку разреден череп
Создадете дијаметар од 0,5 до 1,5 мм. Користете компримиран воздух за да ги отстраните коскените фрагменти при дупчење. Изведете го дупчењето наизменично за време на постапката на разредување за да избегнете прегревање од триење. Изладете ја вежбата со раствор на собна температура и редовно нанесувајте пуфер во разредената површина за да ја апсорбира топлината.
ЗАБЕЛЕШКА: За да избегнете оштетување на кората, не вежбајте на големи површини (> 1,5 мм), освен тенок слој (задолжителна претплата. Ве молиме препорачајте да се придружите на вашиот библиотекар.
Резултати од репрезентацијата
1) хроничен прозорец на мозокот и 2) истенчување на черепот, за посттрауматско снимање на мозок кај трансгени глувци: Оптимизиравме два оперативни процеса. Шематски приказ на истражните производи е во Сл. 1 прикажано. Трауматско боцкање низ надворешна челична игла со дијаметар од 0,3 mm (30 G) на бунарот за дупчење (Слика 1А) вознемирен. Успешна подготовка на прозорецот на черепот овозможува снимање на длабочина до 650 μm под површината на пиата (Слика 1Б), додека слабеењето на черепот има тенденција да има ограничување од околу 300 μm (1С) наметне, како и во 3Д реконструкцијата, Thy1-YFP-доказ H кортикални пирамидални клетки на глувчето.
Траечката траума резултира со елиминација на дендритите и уништување на капиларните мрежи во контролиран волумен на церебралниот кортекс. Во текот на првите два дена, областа на лезијата се зголеми, а траумата предизвика дендритично плускавство и формирање на луковици од дендрична ретракција во областите на перилезија, како што е наведено со употреба in vivo мултифотонска микроскопија (Слика 2) набудувано.
Ние извршивме активирање на черепот и прва миграција на микроглијалните глувци CX3CR1-EGFP веднаш по повредата (Слика 3А). Снимката SHG нуди вредна алатка за прецизирање на местото на повредата (3Б) да се разграничи. Екстрацелуларните молекули на матрицата кои произведуваат SHG сигнали се високо збогатени во мозочен паренхим при боцкава траума. Прво на сите, се повикуваат фини микро процеси, а потоа клетките на микроглија мигрираат на границата на местото на повредата (Слика 3А).
За да се проценат можните повреди предизвикани од воведување на тенка стаклена пипета и испорака на боја, извршуваме in vivo експерименти со микроинјекција на два фотони со микроинјекција на сулфородамин 101 кај глувци Thy1-YFP-H без мозочна траума. Во Сл. 4 Прикажаните репрезентативни слики покажуваат место на микроинјекција 3 часа по инјекцијата. Трага од вметнување пипета во менингите од SHG (4А) препознаваат визуелизирани. Астроцити со сулфородамин 101 со инјекција (Слика 4Б) воведени обележани. Под промоторот Thy1, дендритите YFP не изразуваат морфолошки знаци на повреда како што се плускавци или кршење светилки. (Слика 4 В) да демонстрира.
Слика 4. Студија за оптеретување на ткивата направено со раствор за инјектирање преку стаклена микропипета. А. Една трага (прикажана со испрекината линија) во SHG визуелизација на менингите 3 часа по инјекцијата. Б. Астроцити обележани со сулфородамин воведени со инјекцијата. Ц. Дендритите го изразуваат YFP под промоторите на Thy1. Д. Комбинирана слика на А. (SHG - сива), Б. (Астроцити - црвена), Ц. (нервни дендрити - жолта).
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Дискусија
Траумата на мозокот е ненадеен, непредвидлив настан. Овде, го опишуваме животинскиот модел кој репродуцира спектар на крв кај човечки пациенти по оштетување на мозокот, како што се невродегенерација, отстранување на дендрити, едем на мозок, лузни на глијал, крварења во церебралниот кортекс поврзани со фокално субарахноидално крварење и зголемена пропустливост на патолошките промени забележани -Бариера на мозокот. Со цел да се испита примарната и секундарната патогенеза, како и закрепнувањето по траумата, овој модел на повреда беше комбиниран со надолжна ин виво визуелизација на фини нервни и глијални структури. Користени се трансгенични линии на глувци кои изразуваат флуоресцентни протеини микроглија (CX3CR1-EGFP) 9 во неврони (Thy1-YFP-H) 7, астроцити (GFAP-EGFP) 8 или. Покрај тоа, ние употребивме слики од втора хармонична генерација (SHG) и оптоварување на астроцити со сулфародамин 101 10.
Моделот опишан овде рекапитулира пенетрација на типот на повреда на мозокот. Затоа, ограничување на сегашниот модел е тоа што тој не дава информации за механизмите на затворена повреда на главата. Неодамна, Шверт и коавторите пријавија резултати од мултифотонско снимање за однесувањето на клетките во периконтуоналниот кортекс 6. Имајќи предвид дека повредата на затворена глава е чест медицински случај, методолошкиот пристап пријавен од авторите е многу ветувачки за традиционалните истражувачки методи во областа на ефектите на мозокот. Додаток на траума 11.
Користевме и хроничен преглед на черепот 12 и 13 препарати за слабеење на черепот за да го проучуваме однесувањето на клетките под пост-трауматски услови во живиот мозок. И двата методи имаат одредени предности и ограничувања. Така, хроничниот прозорец на мозокот обезбедува подобра резолуција, подобрена оптичка длабочина на продирање во мозочното ткиво и погодност за повеќе единици за сликање. Спротивно на тоа, помала е веројатноста да предизвика воспаление на местото на снимање на истенчување на черепот и, можеби уште поважно, дозволува повторна примена на лекови и бои. Постојат неколку примери на фармаколошки агенси што треба да се користат во овој вид експерименти Табела 1 наведени.
Табела 1. Фармаколошки агенси и бои за инјектирање во модел на повреда на кортикално лансирање.
Широк спектар на биохемиски настани, кои се многу важни под физиолошки и патолошки услови, може да се испитаат со хемиски инхибитори, флуоресцентни индикатори и мутиран протеин воведен преку вирусни конструкции. Предностите од изборот на специфични временски прозорци обезбедени од препаратот за разредување на черепот може да бидат многу релевантни за овие студии.
Во оваа студија го генериравме вториот хармоничен сигнал за обележување на местото на повредата. Алтернативно, границите на местото на повредата може да бидат означени со слабо расејувачка флуоресцентна боја, на пример, флуоресцентен конјугат на декстран со висока молекуларна тежина (2 милиони далтони).
Неодамна, Шафер и неговите колеги 14 користеа хроничен производствен прозорец со череп за повторно испорака на флуоресцентни бои на кортексот на глувчето. Веројатно е дека повторното отворање на прозорецот на черепот може негативно да влијае на транспарентноста на мозочното ткиво. Покрај тоа, тешко е да се предвиди временскиот тек на воспаление предизвикано од повторно внесување, што може да влијае на повторно растење на сврзното ткиво.
Голема предност на разредената измислица на черепот е можноста за испорака на терапевтски соединенија (и други материјали што бараат локална инјекција во мозочното ткиво) повеќе пати за време на прогресијата на траумата, без комплицирање на артефактите (на пример, без продолжување на прозорецот на мозокот).
Во случаи кои не бараат директен пристап до повредената област, препорачуваме разредување на разредената површина на черепот со стаклена обвивка како што е опишано во хартијата и челикот на полиран препарат на черепот од страна на Клајнфелд и неговите колеги 15. Ова може да се направи со следниве изборни процедури. Ставете мала капка агароза (1,5%) на разредениот регион на черепот, почекајте да се гелира, отстранете ја непотребната агароза, па само оставете ја на местото на повредата. Агарозата треба да го заштити местото на повредата од надворешни влијанија. Исушете го разредениот дел од главата со компримиран воздух. Оставете мала количина полиакрилен лепак на мало парче навлака # 0 и ставете го на разредениот дел на черепот. Лепилото спречува повторно растење на полиакрилната коска и сврзното ткиво, и на тој начин го одржува разредениот череп зачуван под прозорецот.
Комбинација на овие постапки овозможува проучување на акутни и хронични посттрауматски процеси и доставува лекови локално или системски и директно ги следи ефектите на третманот. Употребата на двојни или тројни трансгени линии на глувци исто така може да биде корисна, парки-празници, за истовремено прикажување на повеќе пост-трауматски процеси, како што се лузни на глијални клетки и повторно растење на нервните гранки. Очекуваме дека нашите модели на акутно оштетување на мозокот испитани со употреба на интравитална микроскопија со два фотони за да се покажат плодни за тестирање на кандидати за лекови.
Потребна е претплата. Ве молиме, препорачајте JoАВО на вашиот библиотекар.
Откривање
Авторите немаат што да откријат.
Признанија
Длабоко сме благодарни што д-р. Френк Кирхоф за обезбедување на соеви на глувци GFAP-EGFP и CX3CR1-EGFP. Работата беше поддржана од грантови од Центарот за меѓународна подвижност на Финска, Текес, Финското дипломирано училиште за невронаука (FGSN) и Академијата на Финска.