Бришењето Tbc1d1 ја потиснува дебелината кај глувци со недостаток на лептин - меѓународен весник
предмети
апстрактен
Позадина:
Варијанти на генот TBC1D1 се вмешани во одлики поврзани со дебелината кај неколку видови, вклучувајќи луѓе, глувци, зајаци и кокошки. Додека варијантите на TBC1D1 се поврзани со дебелината кај луѓето, нарушувањето на генот Tbc1d1 ја намали телесната тежина кај глувците. TBC1D1 е идентификуван како регулатор на инсулин-зависен транспорт на глукоза во скелетните мускули, но неговата улога во енергетската хомеостаза во дебелата состојба останува нејасна. Истражувано е влијанието на дефицит на TBC1D1 врз енергетската хомеостаза, метаболизмот на глукозата и липидите во утврден модел на глувци за дебелина.
Методи:
Дебели лептин (об/об) и глувци со двојно недостаток на Тбц1д1 (Д1КО-об/об) се генерирани со вкрстување на прекумерната тежина Б6. V. Леп ОБ/ОБ глувци со слаби глувци со дефицит на Tbc1d1 на позадина C57BL/6J. Машките глувци кои примале или стандардна диета (СД) или диета со многу маснотии (ХФД) биле проценети за телесната тежина, составот на телото, внесувањето храна, доброволната физичка активност и потрошувачката на енергија со индиректна калориметрија. Анализирана е толеранција на глукоза и инсулин, како и транспорт на глукоза и оксидација на масни киселини во скелетните мускули.
Резултати:
Кај дебелите глувци, дефицитот на Tbc1d1 доведе до намалување на телесната тежина во SD и HFD. Сепак, внесувањето храна остана непроменето на СД, па дури и се зголеми кај глувците со дефицит на Tbc1d1, хранети со HFD, без никаква промена во доброволната физичка активност. И покрај значително намалениот транспорт на гликоза стимулиран од инсулин и зголемената оксидација на масни киселини во непроменети изолирани скелетни мускули, дебелите глувци со дефицит на Tbc1d1 не покажаа значителни промени во гликемијата и толеранцијата на гликоза во споредба со контролираните дебели. Индиректната калориметрија покажа дека дебелите глувци со недостаток на Tbc1d1 имаат намален респираторен количник заедно со зголемена дневна потрошувачка на енергија.
Заклучоци:
Кај дебелите глувци со недостаток на лептин, недостатокот на TBC1D1 нема никакво влијание врз однесувањето на хранењето или внесот на енергија, но тоа доведува до зголемена потрошувачка на енергија, предност на изменета енергија на супстрат со зголемена оксидација на масни киселини и сузбивање на дебелината. TBC1D1 може да има еволутивно зачувана улога во регулирањето на енергетската хомеостаза кај 'рбетниците.
вовед
материјали и методи
материјали
Хуман рекомбинантен инсулин (Actrapid HM Penfill) е купен од Ново Нордиск Фарма ГмбХ, Мајнц, Германија и AICAR (Аминоимидазол Карбоксамид Рибонуклеотид) е купен од Енцо Лајф Саинс, Лоерах, Германија. Радиохемикалии се добиени од Хартман Аналитик, Брауншвајг, Германија ([1- 14 C] -D-Манитол, 0,1 mCi ml -1) и од American Radiolabeled Chemicals, St. Louis, MO, САД ([9, 10 (n) - 3 Н] палмитинска киселина, 1 mCi ml-1; 2- [1, 2- 3 H (N)] деокси-Д-глукоза, 1 mCi ml-1).
Генерација на дебели животни со недостаток на Tbc1d1
Генотипизација
Геномската ДНК од врвовите на опашката на глувчето беше изолирана со помош на InViSorb геномска ДНК комплет II (Инвитек, Берлин, Германија). Глувците биле генотипизирани за Tbc1d1 (D1KO-Fwd: 5'-CAA-CAT-TCT-GAA-GGC-CTT-CTG-3 ', D1KO-Rev: 5'-TCC-CTG-ACA-AGC-TGA-GT- 3 '; WT-Fwd: 5'-GGA CAA GCA GCTT TCT TGT TT-3', WT-Rev: 5'-TCC TGG TCC AGA AGC GAG-3 ') и за паралелната (Fwd: 5'- TGT CCA AGA TGG ACC AGA CTC-3 '), Rev: 5'-ACT-GGT-CTG-AGG-CAG-GGA-GCA-3').
Екстракција на РНК и синтеза на cDNA
РНК е извлечена од разни ткива на глувци со помош на QIAzol и мини комплет RNeasy (Qiagen, Хилден, Германија) според упатствата на производителот. ЦДНК е транскрибиран од 2 μg вкупна РНК со употреба на GoScript Reverse Transcriptase (Промега, Манхајм, Германија) и случајни хексамери P (dN) 6 (Рош, Манхајм, Германија).
Квантитативна PCR во реално време
Квантитативната PCR во реално време беше извршена со употреба на сонди TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) за Tbc1d1 (Mm00497989_m1), PrlR (Mm00599957_m1) и за Actb (FAM-TTG AGA CCT TCA ACA CCC CAG CCA-TAMRA) . MWG, Еберсберг) како ген за домаќинство. Анализите се извршени со Брз реално време PCR систем 7500 од применети биосистеми (применети биосистеми). Податоците се нормализираа според методот ΔCt со одземање на Ct вредноста на бета-актинот од Ct вредноста на целниот ген. 16
Анализа на телесната тежина, составот на телото и должината на телото
Вкупната телесна тежина беше анализирана со електронска рамнотежа (Сарториус, Гатинген, Германија). Составот на телото (телесна маст и чиста маса) се утврди со нуклеарен магнетна резонантна спектрометар (анализатор Bruker-Minispec NMR mq10, Bruker Optics, Ettlingen, Германија). Должината на телото беше анализирана со мерење на должината од носот до анусот.
Тестови за толеранција на гликоза, инсулин
После постот преку ноќ, животните добиле орален болус за глукоза (2 g на кг телесна тежина, 20% раствор) преку сонда. Примероците од крвта беа извлечени од врвот на опашката во различни периоди (0, 15, 30, 60 и 120 минути) и беа утврдени нивоата на гликоза и инсулин како што е опишано подолу. За тестот за толеранција на инсулин, глувците постеле преку ноќ и 2 IU инсулин на кг телесна тежина се инјектирале интраперитонеално. Гликозата во крвта беше утврдена 0, 15, 30 и 60 минути по инјекцијата.
Параметри на крвта
Шеќерот во крвта беше утврден со глукометар (Контура, Баер, Леверкузен, Германија). Плазматскиот инсулин е измерен со ЕЛИСА (Инсулин глушец ултрасензитивен ЕЛИСА, Алпко, Салем, М.А., САД), плазма кетонски тела со комплет за автомобили Вкупно кетонски тела, слободни маснотии, киселини со системот NEFA-HR 2 (обајцата Вако Хемикали, Нојс, Германија ) Адипонектинот беше анализиран со комплетот глувче Адипонектин ЕЛИСА (Millipore, Billerica, MA, САД), адипоцитокините IL-6, MCP-1, PAI-1 и Resistin беа анализирани со Milliplex MAP комплет, глушец серум Adipokine (Millipore) и IGF -1 со системот за развој на DuoSet ELISA (R&D Systems, Abington, Велика Британија). Триглицеридите и слободниот глицерин се утврдени со комплетот за одредување на серумскиот триглицерид (Сигма-Олдрич, Штајнхајм, Германија). Сите параметри на плазмата беа утврдени како што е опишано од производителот.
Анализа на внесување на гликоза и оксидација на масни киселини во изолирани скелетни мускули
Глувците биле под анестезија и мускулите на екстензорот дигиториум долги и единствени од задните нозе биле внимателно расчленети. Медиумот за инкубација се состои од пуфер на бикарбонат Кребс-Хенселеит дополнет со 5 mM HEPES и 0,1% говедски серумски албумин без масна киселина. Инкубацијата беше извршена во водена бања (30 ° C) со континуирано гасење (95% O 2/5% CO 2) и нежно мешање. За да се утврди внесувањето на гликоза, мускулите на екстензорот дигиториум долгус беа инкубирани 30 минути со 5 мм глукоза и 15 мм манитол во отсуство или присуство на 120 nM инсулин. После последната инкубација со 1 mM [3H] 2-деокси-глукоза (2,5 mCi ml-1) и 19 mM [14 C] манитол (0,7 mCi ml-1) 20 минути, мускулите веднаш беа во течен азот и мраз складирани замрзнати на -80 ° C. За да се утврди стапката на оксидација на масни киселини, мускулите на солеусот се инкубираат во пуфер бикарбонат Кребс-Хенселејт кој содржи 5 мм гликоза, 15 мм манитол, 3,5% безмасна киселина горумски серумски албумин, 4 мЦи мл -1 [ 3 H] палмитат и 600 μM содржеа неозначен палмитат со или без 2 mM AICAR на 30 ° C за 120 минути и радиоактивноста беше измерена со броење на сцинтилација на медиумот.
Индиректна калориметрија
Анализите на респираторниот количник и ЕЕ се опишани на друго место. 7 Накратко, животните поминаа низ фаза на адаптација од 24 часа пред мерењето. Кафезите беа ставени во климатска комора на 22 ° C, а потрошувачката на кислород (VO 2) и производството на јаглерод диоксид (VCO 2) беа следени 23 часа со проток од
Feed-пијалок
Внесувањето храна и физичката активност беа следени со автоматски систем за анализа на ТСЕ (тип 302015-c/32, ТСЕ системи, Бад Хомбург, Германија). Animивотните имаа слободен пристап до храна и сензори за вода и тежина на корпите за храна, ја бележеа количината на храна потрошена од секое животно. Физичката активност беше одредена со инфрацрвени сензори.
Анализа на западно размачкување
Триглицериди во црниот дроб
Ткивото на црниот дроб се хомогенизираше во 10мм тампон на натриум фосфат со 1% полиоксиетилен-10-тридецилетан и 1 мМ ЕДТА со помош на ткивен лизер (Qiagen). Хомогенатот беше инкубиран 5 мин на 70 ° C и центрифугиран 10 мин на 16,000 рсф. Триглицеридите на црниот дроб се измерени во супернатантот со употреба на комплет (TRIGS) (Рандокс, Крамлин, Велика Британија) како што е опишано во упатството.
Гликоген во ткиво
Ткивата се хомогенизирани во 1 M KOH, се инкубираат 30 мин на 70 ° C и се неутрализираа со концентрирана оцетна киселина. Додадена е амилоглукозидаза (Сигма-Олдрич) и примероците се инкубираат преку ноќ на 37 ° С. По центрифугирање (10 мин., 2000 rcf), гликозата во супернатантот беше измерена со Glucose Liquicolor (Хуман, Taunusstein, Германија) според упатствата на производителот.
Резултати
Бришењето на Tbc1d1 доведува до значително намалување на телесната тежина кај дебелите глувци
Тежина на телото и состав на тело на глувци WT и D1KO ob/ob. ( а ) Телесна тежина, ( б ) Вкупна телесна масна маса и ( в ) Посно тело од машки глувци WT и D1KO-ob/ob одгледувани на SD или HFD. Податоците претставуваат средства ± полувреме; n = 17-30 (SD) и n = 6-23 (HFD); * P − 1 на 24 часа ± 0,054 kJ g − 1 на ден) 24 часа; D1KO-ob/ob: 1,44 kJ g-1 на 24 h ± 0,09 kJ g-1 на 24 h). При хранење на HFD, количината на потрошена храна е значително зголемена кај послабите глувци D1KO-ob/ob во споредба со животните WT-ob/ob (WT-ob/ob: 1,32 kJ g-1 на 24 h ± 0, 054 kJ) g − 1 на 24 часа; D1KO-ob/ob: 1,63 kJ g-1 на 24 h ± 0,087 kJ g − 1 на 24 h; P = 0, 00015). Покрај тоа, анализата на внесот на храна кај помлади глувци стари 7 недели покажа слични резултати без значителни разлики кај животните кои се хранат со СД и зголемена потрошувачка на храна кај глувци со D1KO-ob/ob-дефицитарни со Tbc1d1-хранети со HFD. .
Внес на храна и физичка активност на глувци WT и D1KO. ( а ) Распределба на ткиво на TBC1D1 кај 16-годишни машки глувци WT-ob/ob, анализирано со Western blot. ( б ) Изразување на Tbc1d1 во различни мозочни региони на дебели глувци WT и D1KO-ob/ob, како и кај слаби глувци WT-ob/+ и во скелетни мускули (М. квадрицепси) на глувци WT и D1KO-ob/ob, кои биле извршени од беа анализирани квантитативни PCR во реално време со бета-актин како ген за домаќинство. Изразот на Tbc1d1 беше нормализиран до израз на WT глувци во скелетните мускули. Глувците имале 16 недели и хранеле СД; Податоците претставуваат средства ± полувреме; n = 6-10. ( в ) Внесот на храна се мери во текот на 24 часа, прилагоден на вкупната телесна тежина и ( г. Доброволна физичка активност анализирана од инфрацрвени зраци во машки глувци стари 15 недели, одгледувани или со SD или со HFD. Податоците претставуваат средства ± полувреме; n = 5-11; * P −1 ± 0,032 kJ g −1; D1KO- об/оп: 2,78 kJ g − 1 ± 0,032 kJ g − 1; P = 0,009) (Слики 3в - г).
Гликемиска контрола на глувци WT и D1KO-ob/ob. ( а ) Гликоза во крвта на машки глувци стари 17 недели во состојба после јадење на SD или HFD. ( б ) Гликоза во крвта од машки глувци стари 12 недели хранети со СД и ( в ) соодветни нивоа на инсулин во плазмата за време на орален GTT со 2 g глукоза на кг. ( г. ) Гликоза во крвта на машки глувци стари 14 недели одгледани на СД со 2 IU инсулин на кг за време на тест за толеранција на интраперитонеална инсулин. Податоците претставуваат средства ± полувреме; n = 5-9; * P 3H] 2-деокси-глукоза во скелетниот мускул анализирана како што е опишано. Како што е прикажано на Слика 5а, обете групи со дефицит на лептин покажаа намалено внесување на глукоза под стимулација на инсулин во споредба со животните со чиста контрола WT-ob/+ (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg-1 на 20 минути ± 0,40 nmol mg -1 на ден) 20 мин; WT-ob/+: 6,09 nmol mg-1 на 20 min 0,039 nmol mg-1 на 20 min; P = 0,079). Сепак, глувците D1KO-ob/ob покажаа значително намалено инсулин-стимулиран внес на глукоза во споредба со глувците WT-ob/ob (WT-ob/ob: 4,63 nmol mg-1 на 20 min ± 0,40 nmol mg-1 на 20 мин; D1KO-об/об: 3,26 nmol mg –1 на 20 min ± 0,19 nmol mg –1 на 20 min; P = 0,0019).
Влијанието на зголемената оксидација на масни киселини врз развојот на телесната тежина е, сепак, контроверзно. Во две независни студии со глувци Acc2 -/- се сугерираше дека е доволен поголем прилив на масни киселини во митохондриите за да се зголеми ЕЕ и да се намали телесната тежина. 21, 22 Во една од овие студии, се покажа дека глувците Acc2 -/- имаат намалено ниво на малонил-CoA и затоа ја зголемуваат β-оксидацијата во скелетните мускули. 21 Во втората студија, авторите забележаа зголемување на ЕЕ и намалување на телесната тежина кај глувците Acc2 -/- и дојдоа до заклучок дека овие ефекти може директно да се припишат на зголемено снабдување со масни киселини и последователно зголемување на оксидацијата во митохондриите . Спротивно на тоа, една неодамнешна студија со глувци Acc2 -/- од Хоен и колегите 23 не открила никакви промени во ЕЕ или телесната тежина, што сугерира дека зголемената β-оксидација можеби не е доволна за да се објасни ефектот што го потиснува дебелината на Глувци со недостаток на лептин и Tbc1d1.
Дебелината е во корелација со намалена чувствителност на инсулин, и обратно, се очекува дека намалувањето на содржината на телесни масти доведува до зголемување на чувствителноста на инсулин. 24 Иако глувците со дефицит на Tbc1d1 D1KO-ob/ob со помала содржина на вкупна телесна маст од контролите беа значително пониски, нивото на шеќер во крвта не беше намалено. Покрај тоа, ниту толеранцијата на гликоза ниту чувствителноста на инсулин беа значително променети кај овие глувци, што укажува на тоа дека намаленото ослободување на глукоза во скелетниот мускул на глувците D1KO-ob/ob со дефицит на Tbc1d1 компензира за корисниот ефект на супресија на дебелината врз гликемијата кај овие глувци може.
Мутациите во TBC1D1 се поврзани и со контрола на телесната тежина кај луѓето. Две студии покажаа врска помеѓу кодирањето на варијантата R125W и индексот на телесна маса (БМИ) кај жени подложни на дебелина, додека полиборфизмот на единечен нуклеотид TBC1D1 кај мажи и жени од ЕПИК Потсдам најде силна поврзаност со БМИ и обемот на половината стана кохорт. 10, 11, 25 Соодветните студии на животни врз свињи, зајаци и кокошки покажаа врска помеѓу варијантите на TBC1D1 и составот на телото и дебелината. 12, 13, 14, 15 Нашата сегашна студија кај дебели глувци сугерира дека TBC1D1 игра еволутивно зачувана улога во регулирањето на телесната тежина и составот на 'рбетниците. На молекуларната основа на ова набудување и можниот еволутивен избор на варијанти на TBC1D1 им треба дополнително истражување.