ДИСЕРСТАЦИЈА за добивање докторат на одделот за хемија
1 Определување на производи за радиолиза на аминокиселини орто-тирозин и 3- (4-хидроксифенил) пропионска киселина како доказ за γ-зрачење на храна богата со протеини РАСПОЛНУВАЕ за добивање на докторска диплома од Катедрата за хемија на Универзитетот во Хамбург од Институтот за биохемија и хемија на храна при Универзитет за хемија на храна претставена од Јана Хушкова од Кладно Хамбург 23
2 Тековната работа беше спроведена помеѓу октомври 1998 и 22 септември под раководство на професорот др. Д-р Ханс Стајнхарт на Институтот за биохемија и хемија на храна - оддел Хемија на храна. 1 рецензент: проф. Д-р. Д-р Ханс Стајнхарт 2-ри рецензент: проф. Д-р. Биспинг
3 Признанија Во овој момент би сакал да им се заблагодарам на сите што ме поддржаа во подготовката на оваа теза: Проф. Д-р Би сакал да му се заблагодарам на Ханс Стајнхарт за укажувањето на темата и големата поддршка. Проф. Му благодарам на Биспипинг што ја презеде презентацијата. Д-р Би сакал да му се заблагодарам на Томас Симат за неговата постојана подготвеност за дискусија и соработка, што придонесе за успехот на оваа работа. Би сакал да им се заблагодарам на сите колеги во Одделот за хемија на храна на Универзитетот во Хамбург за нивната добра соработка. Би сакал да им се заблагодарам на компаниите Beiersdorf AG и GAMMASTER GmbH за зрачењето на примероците. Им благодарам на Дајмлер-Бенц и Фондацијата Х. Вилхелм Шауман за финансиската поддршка на ова дело. Им благодарам на моите родители за нивното неисцрпно трпеливост. Би сакал да им се заблагодарам на моите пријатели Рут, Јиржи, Роберт, Брита, Астрид, Керстин, Луи и Маријана за корекција и друга разновидна поддршка.
4 Список на кратенки 4 Список на кратенки 3,2-HPPA 3,3-HPPA 3,4-HPPA λ Ex λ Em AP-ESI BgVV CV Em ESR EU Ex FAO FIA FL FLD GC HCl HPLC IAEA Е kgy LMBG M m/z MeCN MeOH мин MS MSD MW n 3- (2-хидроксифенил) -пропионска киселина 3- (3-хидроксифенил) -пропионска киселина 3- (4-хидроксифенил) -пропионска киселина Возбушна бранова должина Емисија на бранова должина Атмосферски притисок Електроспреј јонизација Федерален институт за заштита на здравјето на потрошувачите и ветеринарна медицинска варијанта Анализа на инјектирање на проток на организација и земјоделство Флуоресцентна детекција на флуоресценција Гасна хроматографија Хлороводородна киселина течна хроматографија со високи перформанси Меѓународна агенција за атомска енергија Внатрешен стандард кило-сива храна и стоки Закон за сооднос на молекуларна маса на полнење ацетонитрил метанол минута маса спектрометрија масовно селективно откривање
5 Список на кратенки 5 н.н. н.б. NH 4 ацетат NH 4 формат NWG PE Phe RP RT SIM SPE TFA TL Tyr UV v/v WHO WFR не се детектира не е утврдено амониум ацетат амониум формат граница за откривање полиетилен фенилаланин обратна фаза собна температура мониторинг на една јонска монтажа солидна фаза екстракција трифлуороацетна киселина термолуминисценција обновување на тирозин светлина
6 Содржина 6 Содржина 1 ВОВЕД ЦЕЛ ТЕОРЕТСКИ ПРИНЦИПИ Озрачување на храната Хемиски ефекти на јонизирачко зрачење Примарен ефект на озрачување Средно дејство на зрачење Влијание на доза на зрачење Влијание на стапка на доза Влијание на температурата при зрачење Промена на храна за време на замрзнување РАЗВОЈ НА МЕТОДИ ЗА ОДРЕДУВАЕ НА О-ТИРОСИН Оптимизација на хроматографски услови Оптимизација на детекција Откривање на флуоресценција (FLD) Селективно откривање на маси (MSD) Развој на чистење Депротеинизација Хомогенизација Изолација на отир со помош на извлекување на цврста фаза Дискусија на -ХИДРОКСИФЕНИЛ) -ПРОПИОНСКА КИСИНА Оптимизација на хроматографските услови. 43
7 Содржина Оптимизација на откривање Развој на чистење Изолација на депротеинизација и збогатување на 3- (4-хидроксифенил) пропионска киселина со помош на екстракција на течна течност Изолација и збогатување на 3- (4-хидроксифенил) пропионска киселина со помош на екстракција на цврста фаза Валидација Дискусија ДЕТЕРМИНАНИЈА НА ФЕНИЈАТА И П-тирозин во РЕТЕРИНИРАATIONЕ НА О-ТИРОСИН ВО Зрачената со Р-РЕТИИНСКА ХРАНА Влијание на температурата Определување на о-тирозин во РТ зрачена со храна протеини Определување на о-тирозин во замрзната, озрачена храна богата со протеини Влијание на протокот на храна на зрачење - застаклување на нивоата на о-тирозин во позадината на озрачените примероци Однос помеѓу содржината на фенилаланин и зрачењето предизвикано од формирање на о-тирозин ОДРЕДУВА 3-Е НА 3- (4-ХИДРОКСИФЕНИЛ) -ПРОПИОНСКА КИСИНА ВО Зрачените со протеини-богати храни Однос помеѓу содржината на п-тирозин и зрачење предизвикано од формирање на 3- (4-хидроксифенил) пропионска киселина РЕЗИМЕ НА ДИСКУСИЈА - РЕЗИМЕ Резиме Резиме ЛИТЕРАТУРА. 82
9 Содржина Анјонски разменувачи Процена на валидација за одредување на 3- (4-хидроксифенил) пропионска киселина Определување на 3- (4-хидроксифенил) пропионска киселина во храна богата со протеини со γ - резултати на γ-зрачење на храна Определување на 3- (4-хидроксифенил) - хроматограми на пропионска киселина. 125
14 1 Вовед 14 реагираат истите производи за оксидација. Новиот пристап за идентификација на г-озрачена со протеини богата и истовремено храна со малку маснотии нуди одредување на новиот потенцијален маркер за зрачење 3,4-HPPA. Врз основа на скрининг, КЛИБЕРГ (22) го откри овој производ за радиолиза на аминокиселини во разни јадења богати со протеини γ, како што се ракчиња од Северно Море, пилешки гради и други видови ракчиња. Овој маркер за зрачење можеше да се забележи и на собна температура и во замрзната зрачена храна. Најдени се значителни разлики помеѓу 3,4-HPPA нивоа во не-озрачени и озрачени примероци. 3,4-HPPA е определен со употреба на HPLC/FLD. Оваа постапка сè уште не е во можност да се користи како рутинска постапка.
16 3 Теоретски основи 16 3 Теоретски основи 3.1 Озрачување на прехранбени производи Три различни видови зрачење се дозволени за озрачување на прехранбени производи (CODEX ALIMENTARIUS, 1984): γ-зраци на радионуклидите 6 Co (се вештачки произведени од 59 Co, две γ-кванти со емитирани со енергија од 1,17 MeV и 1,33 MeV) γ-зраци на радионуклидите 137 Cs (од нуклеарна фисија, се емитува γ-квант со релативно мала енергија од 0,66 MeV) β-зраци до енергија од Х-зраци од 1 MeV (секундарно зрачење од електронски забрзувачи) до енергија од 5 MeV. За зрачење со храна, најчесто се користат γ-зраци, бидејќи тие имаат голем капацитет за продирање на материјата во споредба со β-зраците и затоа се добро прилагодени за зрачење на производи на палети (DIEHL, 1995). Во зависност од областа на примена на зрачењето, се користат различни дози на зрачење од 0,5 до 1 kgy. Опсегот на високи дози од повеќе од 1 kgy не е одобрен за комерцијална храна, но се користи за специјални намени за стерилизација. Некои области на примена со максимално дозволени дози на зрачење се наведени во Табела 2 (МААЕ, 2).
18 3 Теоретска основа 18 радиолитички поделена, при што во суштина се јавуваат следниве производи за радиолиза (Екви. 4) (DRAGNIC and DRAGNIC, 1963, VON SONNTAG, 1987, DODD, 1995): H 2 O OH + e - aq + H + H 3 О + (Еквил. 4) Секундарен ефект на зрачењето Слободните радикали формирани од примарниот ефект на јонизирачкото зрачење се многу реактивни и можат да реагираат едни со други или со состојките на храната, што доведува до секундарни производи на зрачењето. Резултирачките видови можат да продолжат да реагираат на следниов начин (Eq. 5, 6, 7): R + H RH комбинација (Eq. 5) R + R RR димеризација (Eq. 6) RH + + e - aq RH фаќање на електрони (Eq. 7 ) Хидроксилните радикали како примарни производи за радиолиза на вода имаат силно оксидативно дејство. Овие се особено реактивни кон незаситените соединенија и оние со ароматични прстени (KARAM and SIMIC, 1989, WANG et al., 1993). Кога еден радикал на OH го напаѓа Phe, тој се додава на ароматичниот прстен, формирајќи четири можни средни (Слика 1). Три од нив (1, 2, 3) доведуваат до формирање на хидрокси-Фе, додека формата Ипсо (4) доведува до непознати производи (WANG et al., 1993). Слика 1: Формирање на радикалите на хидрокси-Фе преку првични и секундарни ефекти
23 3 Теоретски основи 23 Нормализација на дигестивните функции кај (ГУТСМИДТ, 1964). Ензиматски слободни масни киселини се ослободуваат од липидите. Нивното формирање е зависно од температурата и е побавно на пониски температури отколку на повисоки. Ензимите обично не се уништуваат со процесот на замрзнување. Тие можат да бидат целосно активни повторно кога температурата се зголемува. Ензими за расипување на маснотии, на пр. Липазите и липоксидазите се сè уште активни дури и при ниски температури и доведуваат до формирање на производи за распаѓање на маснотии (алдехиди, кетони, киселини, пероксиди) и до распаѓање на фосфатидите (HERRMANN, 197).
31 5 Развој на методи за определување на о-тирозин 31 3 Максимална емисија на максимална емисија на р. Бранова должина (nm) Слика 5: Влијание на вредноста на р на максимумот на возбудување и емисија Оптимизација на интензитетот на флуоресценцијата Флуоресцентните својства на изомерите на Тир зависат од вредноста на р . Поради оваа причина, беше испитано влијанието на pH вредноста на пуферот врз интензитетот на флуоресценција на о-тир, а со тоа и врз чувствителноста на детекцијата. За таа цел, флуориметрично се измерени о-тир растворите во фосфатниот пуфер со pH вредности помеѓу 1,5 и 9,3 (λex = 275 nm, λem = 35 nm). Откриено е дека интензитетот на флуоресценција го достигнува својот максимум во pH опсегот од 4-5 (Слика 6). Интензитет на флуоресценција (%) ph вредност Слика 6: Зависност на интензитетот на флуоресценција на o-tyr од вредноста на ph Следната постапка беше искористена за пренесување на добиените резултати со фосфатниот пуфер во тестираните мобилни фази. О-тир-раствор во оној развиен од HEIN et al. (2) употребени елуенти, 1% TFA (pH 1,8), исто така, се мери флуориметриски (λex = 275 nm, λem = 35 nm). О-тир исто така беше испитан во раствор од, 5 mol/l NH4formate на pH 3, 4 и 4,5. Максималниот интензитет на флуоресценција е добиен со раствор на о-тир во NH4formate пуфер на pH 4