Друштво за диференцијација и пролиферати Макс Планк
Одделение за развој и ремоделирање на срцето (проф. Д-р д-р Томас Браун)
MPI за истражување на срцето и белите дробови, Бад Наухајм
(1) Диференцијација и размножување на клетките за време на развојот и регенерацијата
Молекуларна контрола на диференцијација и регенерација во оштетеното и стареење на срцето
Според општата доктрина, срцето за возрасни се состои од диференцирани кардиомиоцити (клетки на срцевиот мускул) кои повеќе не се во можност да се делат. Бидејќи човечкото срце може да работи континуирано и ефикасно со децении, се претпоставуваше дека индивидуалните кардиомиоцити исто така го преживуваат овој период без поголеми промени. Различни студии покажаа дека стареењето и оштетувањето на срцето неизбежно доведуваат до губење на клетките преку таканаречена програмирана клеточна смрт (апоптоза) со последователни промени во ткивото (некроза). Од ова може да се заклучи дека кардиомиоцитите кај возрасните сè уште имаат преостанат капацитет за самообновување и дека ова е од суштинско значење за одржување на нормалното функционирање на срцето. Досега не е познато кои сигнали и процеси ја одредуваат рамнотежата помеѓу смртта на клетките, преживувањето на клетките и поделбата на клетките.
Работна група на МПИ за истражување на срце и бели дробови во Бад Наухајм бара фактори за раст кои би можеле да го контролираат овој деликатен баланс. Еден од овие фактори е веројатно БМП-10, нов член на семејството БМП (коскени морфогенетски протеини) кој е специфично изразен во мускулни топчиња наречени „трабекули“ во срцевото ткиво и атриумот на срцето во развој на глувчето. Хомозиготните мутанти глувци БМП-10 развиваат рана дисфункција на срцето, што би можело да се должи особено на недостаток на трабекулација, што доведува до умирање на мутантни ембриони помеѓу Е10,5 и 11,5 п.н.е. (по копулација) води. Во ткивна култура, БМП исто така ги штитат кардиомиоцитите од апоптоза. Бидејќи БМП-10 е многу изразен во возрасни глувци и човечки срца, истражувачите ќе ја анализираат улогата на БМП-10 во опстанокот и стареењето на кардиомиоцитите кај трансгенските модели на глувци. Тие очекуваат дека подлабокото разбирање на улогата на БМП ќе доведе до нови терапевтски методи при срцеви заболувања (Сл.1).
Постапките за поправка во стареењето или оштетеното срце се карактеризираат со генерирање на нефункционално ткиво на лузни. Обновување на стареењето на срцето не е можно - како што е објаснето погоре - поради ограничување на способноста на возрасните срцеви мускулни клетки да се делат и недостаток на доволни количини на срцеви матични клетки. Научниците од МПИ затоа се обидуваат да го скршат митотскиот блок на кардиомиоцитите со манипулирање со клеточната машинерија. Особено, тие ја испитуваат улогата на транскрипционите фактори E2F и каталитичката поддиница на ензимот теломераза во започнувањето на клеточниот циклус и потенцијалната употреба на доминантни негативни верзии на p53 и p73 за да се спречи апоптозата на клетките на срцевиот мускул.
Истражувачи: Изабела Пиетровска, Томас Кубин, hiипеи Лиу
На горниот дел од сликата е прикажано срцето на глувчето по лигатура на LAD, коронарен сад. Лигатура на артеријата доведува до јасно видлив масивен срцев удар. На долниот дел од сликата, во срцето е инјектиран аденовирус, кој изразува репортерски ген што може да се направи видлив во едноставна сина боја. Преносот на гените во срцевото ткиво претставува идна опција за третман на срцева слабост.
Срцева регенерација на зелениот тритон (Notophtalmus viridescens)
Некои организми имаат способност да предизвикаат клетки кои се постмитотични кај другите видови повторно да влезат во клеточниот циклус, па дури и да регенерираат цели органи или делови од органи. Добро познат член на ова семејство на животни е тритон Notophtalmus viridescens, кој е познат по својата способност да ги обновува ампутираните екстремитети или опашки и некои други структури. N. viridescens е еден од ретките 'рбетници што е исто така способен да го обнови срцевото мускулно ткиво (Сл. 2) Тим научници од МПИ во Бад Наухајм ги споредуваат изразните профили на неоштетеното и регенерирачко срцево ткиво со цел да се идентификуваат молекулите кои го контролираат регенеративниот капацитет на срцето на тритон. Податоците од овој скрининг се споредуваат со резултатите од сличните екрани на моделот на инфаркт на глувчето. Досега, истражувачите генерирале ДНК чипови со 100.000 cDNA и ги користеле за да идентификуваат гени кои покажуваат диференцијален израз во регенерирачкото и одморено срце. Деталната функционална анализа на молекуларниот пат што ја одредува срцевата регенерација кај тритовите е следниот чекор, кој во моментов се спроведува со употреба на разни пристапи.
Истражувачи: Тило Борхад, iaулија Крузе, Томас Кубин, Томас Бејтгер, Рене Зимерман
Прикажано е „црвено-точки, зеленикаво водно тритче“ (Notophtalmus viridescens), во кое дел од срцето е оштетен (областа нацртана во бело). Неоштетените клетки на срцевиот мускул кои практично отсуствуваат во оштетената област се обоени во зелена боја. За разлика од луѓето, триот може да ја обнови оштетената област, а исто така и во зрелоста сосема нормално срце.
Идентификација на гените кои ја контролираат диференцијацијата на кардиомиоцитите
Различни гени се идентификувани во минатото кои придонесуваат за диференцијација на кардиомиоцитите и за морфогенезата на срцето. Како и да е, многу е веројатно дека значително поголем број на гени играат улога во специфичниот облик на срцето. Сеопфатни функционални пристапи за идентификување на такви гени сè уште не постојат за цицачите. Истражувачка група на МПИ користи стратегија за широк екран на геном заснована на диференцијација на ембрионални матични клетки. Таа користи сложени ретровирусни библиотеки siRNA за да идентификува гени кои играат клучна улога во диференцијацијата на кардиомиоцитите. Идентификуваните гени се користат при диференцијација на ембрионални матични клетки (ES клетки) ин витро со помош на формирање на ембриоидни тела (ИО); Слика 3B) и ин виво со користење на тетраплоидни агрегирани химери.
Истражувач: Андре Шнајдер, Томас Бајтгер, Дитмар фон дер Ахе
Диференцијација на ембрионалните матични клетки (ЕС) во кардиомиоцити по третман на ембрионални тела (ИО) со факторот на раст FGF-2 за три дена. О: недиференцирани клетки; Б: Ембрионални тела по 3 дена третман со FGF-2; C: позитивни кардиомиоцити на Саркомер MyHC (MF-20) диференцирани од ембрионалните тела по третманот со 3ng/ml FGF-2.
Срцево стареење и оксидативен стрес: SIR гени и контрола на енергетскиот метаболизам
Реактивни видови кислород (РОС = радикали на кислород) предизвикуваат мноштво дегенеративни промени во клетката и доведуваат до предвремено стареење на клетките. Општо земено, акумулацијата на РОС се смета за главна причина за зголемено стареење на клетките. Ткивата кои се состојат главно од постмитотични клетки се чини дека се особено подложни на оштетување од РОС, бидејќи имаат само ограничен потенцијал за регенерација. Досега, точните врски помеѓу оксидативниот стрес и стареењето не се целосно познати Сл. 4. Јасно е, сепак, дека зголемениот оксидативен стрес доведува до нестабилност во енергетскиот метаболизам. Неизбалансираниот енергетски метаболизам веројатно доведува до намалена активност на семејството на гени SIR (тивок регулатор на информации). SIR гените се претпоставува дека деактивираат специјални домени на хроматин (преку деацетилација на хистони зависни од NAD) и со тоа да се оствари заштитна функција. Според оваа идеја, прекумерното изразување на SIR2 во квасец (Saccharomyces cervisiae) до значително зголемување на работниот век.
Научниците од МПИ за истражување на срце и бели дробови генерирале разни линии на глувци што им овозможуваат да ја испитаат улогата на оксидативниот стрес, стареењето и инактивацијата на хроматинот. За таа цел, тие конструираа условно активен алел на SOD2 (супероксид дисмутаза), што овозможува инактивирање и активирање на генот во одредени периоди во срцевиот мускул. Во втората серија експерименти, SIR2 cDNA е вештачки премногу изразен во срцето. Понатаму, тие го истражуваат влијанието на нормалната калорична и хипокалорична храна врз оксидативниот стрес и стареењето на клетките користејќи ги соодветните изразни профили на кардиомиоцитите. Тие исто така ја анализираат врската помеѓу оксидативниот стрес и инактивацијата на генот хроматин преку вкрстување на глувци со недостаток на SOD2 со оние кај кои SIR2 е премногу изразен.
Истражувачи: Ева Бобер, Сузана Вајнлих, Олесија Вакрушева
Ензимот „Манганизиран супероксид дисмутаза (MnSOD)“ ја зголемува стапката на преживување на фибробластите под хипероксични услови. Контролните фибробласти и оние кои претерано го изразуваат MnSOD беа култивирани во нормални (20% О2 = „нормоксија“) и хипероксични (85% О2 = хипероксија) услови. Фазните контрастни слики документираат значително повисока стапка на преживување при оксидативен стрес во клетките што преовладуваат MnSOD. Преголемата експресија на MnSOD може да се препознае со зелената флуоресценција (лева страна и центар). Десна страна на сликата: Сината боја ја документира индуцираната стареење (стареење) на клетките по администрација на 200 nm доксорубицин. Во клетките со прекумерна експресија на MnSOD, стареењето во голема мера се спречува.
Контрола на миграцијата на мускулните претходници клетки со индуктивни и автономни сигнали од клетката
Миграцијата е важна карактеристика на миогените клетки (мускулни претходници) за време на органогенезата и регенерацијата на органите. Во минатото, истражувачите беа во можност да покажат дека генот Homeobox Lbx1 ја регулира миграцијата на клетките претходници на мускулите во екстремитетите на клеточен-автономен начин. Нивните резултати докажаа дека Lbx1 е клучен регулатор на миграцијата на мускулните претходници на клетките и е потребен за насочена миграција на клетки претходници на мускулите на задниот екстремитет и екстензорните мускули на предниот екстремитет (Сл. 5) Користејќи cDNA одземање на хетерозиготни и хомозиготни мутирани Lbx1 клетки, научниците беа во можност да идентификуваат разни претпоставени целни гени на Lbx1. Функционалната истрага на овие гени е во тек. Понатаму, работната група ги истражува каскадите за трансдукција на сигналот, кои се неопходни за мобилна подвижност и миграција на мускулни претходници на клетки кај возрасни глувци и пилешки ембриони.
Истражувачи: Стефан Гинтер, Светлана Оустанина
Деактивирањето на генот Homeobox Lbx1 доведува до апсење на миграција на мускулните претходници на клетките во екстремитетите. Ген за известување за бактерии е воведен во генот Lbx1 со насочена мутагенеза. Овој генетски трик ја исклучува активноста на генот Lbx1 од една страна и ги прави клетките видливи во кои Lbx1 нормално би бил присутен од друга страна. Првиот и третиот ред покажуваат хомозиготни мутанти, вториот и четвртиот ред хетерзиготни мутанти. Јасно е видливо на сликите c и i дека мускулните претходници клетки обележани со сина боја не можат да мигрираат во задниот екстремитет, туку „заглавуваат“ во багажникот.
Регулирање на телесната тежина и срцевата функција преку нервните гени на bHLH
Како дел од скринингот за невронски изразени гени на bHLH (фактори на транскрипција кои содржат основен домен на спирала-јамка-хеликс), истражувачите од MPI во Бад Наухајм беа во можност да идентификуваат бројни различни cDNA-гени и гени пред неколку години Особено, тие ги анализираат двата гени NSCL1 и NSCL2. Иако инактивацијата на NSCL1 не резултираше со забележителна невронска дисфункција, глувците-мутирани NSCL1 умираат предвреме, веројатно како резултат на срцеви дисфункции кои можат да бидат предизвикани од вегетативна дисфункција. Глувците со недостаток на NSCL2 страдаат и од повеќе невроендокрини нарушувања (Сл. 6) Комбинираната инактивација на двата гени доведува до намалена пролиферација на нервните клетки и нарушена диференцијација во миризливиот епител.
Истражувачите се заинтересирани за молекуларните и физиолошките процеси кои се основа на овие фенотипови. Особено внимание се посветува на анализата на целните гени на NSCL1 и NSCL2 и врската помеѓу клеточната пролиферација и диференцијација. Еден фокус на идните активности во овој проект е истражување на функцијата на NSCL2 кај возрасен организам и механизмот на абнормалности на срцевиот ритам и вегетативни дисфункции кај мутантите на NSCL1.
Истражувач: Карен Рушке, Томас Шмит
Дебелина поради дисфункција на нервниот систем: Насочената инактивација на основниот фактор на транскрипција на хеликс-јамка-хеликс NSCL-2, што се изразува кај невроните, доведува до изразена дебелина кај глувците. Изгледот на глувчето наликува на човечкиот синдром Прадер-Вили од аспект на неговиот молекуларен потпис.
(2) Подобрување и забрзување на регенерацијата на ткивата: поправка и замена на оштетените клетки на срцето и скелетот на мускулите
Регенеративната медицина е ново и возбудливо поле во биолошките и медицинските истражувања. Таа се заснова директно на резултатите од основните истражувања кои се однесуваат на диференцијацијата и развојот на клетките. Поновите откритија претпоставуваат дека претходните одлуки донесени од клетките не се неповратни, но може да се променат и променат. Таквиот „динамичен концепт за пронаоѓање на идентитетот“ на клетката се заснова на идејата дека одржувањето на клеточниот фенотип бара континуирана регулација. Во принцип, ова значи дека треба да биде можно повторно да се програмираат диференцирани клетки и на тој начин да се зајакнат регенеративните својства на ткивата и органите.
Избор и манипулација на мезенхималните матични клетки за генерирање на миобласти и кардиомиоцити
Мезенхималните матични клетки (МСЦ) се јавуваат во стромата (потпорно ткиво) на разни органи. Коскената срцевина содржи MSC кои се способни да добијат својства на разни видови клетки, вклучително и срцеви и скелетни мускули и невроекодермални клетки (Сл. 7) Употребата на генетски обележани MSC добиени од коскена срцевина им овозможи на истражувачите да добијат увид во потенцијалот на диференцијација на MSC ин виво да се земе по инјектирање во рани ембриони на глувци. Со комбинирање на специфични стратегии за генетска селекција и протоколи за индукција, беше можно да се произведат релативно унифицирани клеточни популации кои имаат карактеристики на мускулни клетки и, доколку е потребно, можат да се користат за терапевтски цели.
Групата работи и на оптимизирање на методите за ефикасен избор и проширување на MSC за генерирање на миобласти и кардиомиоцити. Тие исто така го одредуваат терапевтскиот потенцијал на овие клетки. Сепак, таквиот пристап може да биде успешен само ако е можно да се научат повеќе за сигналите и процесите што се неопходни за одредување и диференцијација во различни клеточни линии.
Истражувач: Фикру Белема Бедада, Керстин Брих
Мезенхималните матични клетки се чини дека го прифаќаат својот идентитет преференцијално преку фузија со постојните скелетни и срцеви мускулни клетки. Овој заклучок е резултат на прикажаниот експеримент, во кој мезенхималните матични клетки беа обележани со црвена боја и култивирани со зелени обоени мускулни клетки над мембраната со пори од различна големина. Мезенхималните матични клетки можат да изразат мускулен протеин (портокалова) само ако големината на порите на филтерот е доволна за да се овозможи слободно поминување на клетките. Ако ова не беше загарантирано, не може да се најдат протеини во мускулите во мезенхималните матични клетки.
Сателитски клетки: контрола на пролиферацијата, излез на клеточниот циклус и диференцијација при регенерација на ткивото
Сателитските клетки се матични клетки на скелетните мускули. Тие се наоѓаат помеѓу базалната ламина и плазма мембраната (сарколемата) на миотубите, каде што се активираат за време на вежбање, мускулни повреди или болести што ги оштетуваат мускулните влакна. Научниците ги анализираат механизмите што ја контролираат пролиферацијата, излезот на клеточниот циклус и диференцијацијата на сателитските клетки при регенерација на мускулното ткиво (Сл. 8) Со трансплантација на генетски обележани клетки од мутанти на глувци со насочени мутации во семејството на гени на факторот за раст на FGF, тие покажаа дека миогените матични клетки се автокрини зависни од FGF. Употребата на доминантни негативни ретровируси сугерира дека FGF иницираат каскада зависна од рас и рал што започнува миграција на клетките.
Истражувачите го утврдуваат потенцијалот на генерички и генетски модифицирани фактори на раст за терапија и спречување на болести на скелетните мускули кај трансгени животни како претклинички модел. Се користат два различни пристапа: 1) генерација на трансгени животински модели за анализа на функцијата на факторите на раст, пред се FGF, миостатин и SF/HGF; 2) Избор на генетски модифицирани фактори на раст заснован на миостатин со модифициран биолошки спектар. Анализата на факторите за раст при регенерација е поддржана од експерименти кои ја испитуваат функцијата на клеточните автономни процеси при активирање и одржување на сателитските ќелии.
Истражувачи: Светлана Оустанина, Михал Миелкарек, Стефан Гинтер, Андре Шнајдер
Генот на спарени кутии Pax7 е одговорен за одржување на базенот на мускулни матични клетки. Сината боја ја означува активноста на генот Pax7 во сателитските клетки, кои се наоѓаат на изолираните мускулни влакна во „сателитска положба“. Кај муктутите на глувчето Pax7, бројот на сателитски ќелии е само малку намален за време на младоста на глувчето (P 11), но тој брзо се намалува со зголемување на возраста (P 60). Покрај тоа, Pax7 мутантните сателитски ќелии покажуваат загуба на изразување на маркерот на матични клетки CD34.