Дводимензионален протокол за електрофореза со гел (превод на германски)
Преглед
Дводимензионална гел-електрофореза (2DGE) е техника што може да разреши илјадници биомолекули од смесата. Оваа техника вклучува два различни методи на одвојување заедно: изоелектрично фокусирање (ИЕФ) и електрофореза на натриумодецил сулфат полиакриламид гел (SDS-PAGE). Ова физички ги одделува соединенијата преку две оски на гел според нивните изоелектрични точки (електрохемиско својство) и нивните молекуларни тежини.
Постапката во ова видео ги опфаќа клучните концепти на 2DGE и општата постапка за карактеризирање на составот на комплексен раствор на протеини. Три примери за оваа техника се прикажани под наслов на апликации, вклучувајќи откривање на биомаркери за започнување и прогресија на болеста, контролен третман кај пациенти и проучување на протеини по пост-преведувачка модификација (ПТМ).
Дводимензионална, или 2Д, електрофореза со гел е техника која, користејќи два различни методи на раздвојување, може да оддели илјадници протеини од една смеса. Една од техниките, електро-фореза на SDS-PAGE или натриум додецил сулфат полиакриламид гел, не ги одделува комплетно комплексните мешавини сама по себе. Електрофорезата со 2Д гел го спарува SDS-PAGE на втор метод, изоелектрично фокусирање или IEF, кое се одделува на изоелектричните точки, овозможувајќи раствор на потенцијално сите протеини во клетката за лизирање. Ова видео ги демонстрира принципите на електрофореза со 2Д гел, општа постапка и некои од неговите биомедицински апликации.
Електрофорезата со 2Д гел започнува со IEF како прва димензија. Секој протеин има pH вредност, наречена изоелектрична точка или pI, каде што нето полнењето е нула. Кога протеинот е изложен на електрично поле, тој се движи кон електродата со спротивен полнеж. Примероци од интерес се имобилизирани рН градиенти или IPG, ленти натоварени со амфолити кои закопале молекули со кисели и основни групи. Електрично поле потоа се нанесува на лентата за градиент на pH, предизвикувајќи протеините да мигрираат сè додека не достигнат pH со што ќе го израмнат pI, каде што ќе го изгубат својот нето полнеж.
Пред да се активира втората димензија, вградените протеини се третираат со СДС, ги денатурираат и обезбедуваат единствен негативен полнеж. Откако ќе завршат, лентите со ИПГ се ставаат на гел од полиакриламид. Применето електрично поле ги влече протеините кон анодата со поголеми протеини кои полека се движат низ гелот.
Откако ќе се оддели протеинската мешавина според pI и молекуларната тежина, мапата на протеомот е визуелизирана со дамки и се идентификуваат протеините од интерес.
Сега, кога разговаравме за принципите на електрофореза со 2Д гел, да ја разгледаме типичната лабораториска постапка.
Пред да се изврши експериментот, протеините мора да се растворат во медиуми. Солубилизација на примерокот се врши со деагрегирање на протеини со комбинација на хаотропни агенси за нарушување на интеракциите на водородната врска, нејонски детергенти, спречување на промена на полнењето на протеините, намалување на агенсите, кршење на дисулфидните врски и пуферите. За да се отстранат мешачките изобилство на протеини и други молекули, материјалот се екстрахира сукцесивно со центрифугирање и собирање од добиениот топчиња; проследено со третман со ендонуклеаза, ензим кој се користи за да не се консумира ДНК што би се мешало во експериментот.
Откако протеините ќе се растворат, лентите за ИПГ се подготвуваат со плакнење со раствор за чистење ленти и оставање да се исушат наопаку. Потоа, на секоја лента е доделен број на држач на лента. Откако ќе заврши, лентата се вчитува во бавно, лизгачко движење од негативниот кон позитивниот пол на клеточниот екстракт. Заради рехидратација, влажната хартија за размачкување се става на електродата и под лентите за гел; лентите со ИПГ потоа се закопчуваат на инструментот ИЕФ. Се применува висока електрична струја и протеините почнуваат да мигрираат.
По завршувањето на првата димензија, гелот е подготвен за SDS-PAGE во уред за истурање. ЛИГ-лентите ќе се третираат со ставање во тампон за рамнотежа што содржи СДС. Единицата за електрофореза се подготвува со додавање на пуфер за електрофореза. Обработените ленти со ИПГ се собираат со форцепс, се ставаат на гел-плочите и се запечатуваат со раствор за запечатување на агароза. Потоа, изворот на напон применува електрично поле што се држи додека протеините кои најбрзо се движат не се 1 см над дното на гелот.
Откако ќе заврши електрофорезата, протеините мора да се визуелизираат. Традиционално, ова се прави со боење со сино или сребро нитрат Coomassie. Протеините што се интересираат се пренесуваат од гелот со анализа на размачкана вестер и се анализираат.
Втор пристап за идентификација вклучува ексцизирање на протеините од гелот, варење, бидејќи тие се анализираат со масена спектрометрија.
Сега, кога разгледавме еден метод, да разгледаме некои од употребите за електрофореза со 2Д гел.
Една од најчестите употреби на оваа техника е идентификување на молекулите вклучени во започнувањето и прогресијата на болеста. Електрофореза со 2Д гел, заедно со масена спектрометрија, ја препознава регулацијата на специфични протеини нагоре или надолу во заболените области во споредба со здравите.
Покрај тоа, електрофорезата со 2Д гел е корисна по напредокот на пациентот како одговор на потенцијален терапевтски лек. Може да се земат примероци од пациенти во различно време по третманот. На овој начин, електрофорезата со 2Д гел поврзана со анализа на западниот размачкан или масовната спектрометрија може да открие протеини поврзани со негативни реакции како што се воспаление; или недостаток на протеини во калена состојба.
Друга област на примена за електрофореза на 2Д гел е проучување на структурата и функцијата на протеините по пост-преведувачка модификација или ПТМ, додатоци на протеините што се по нивниот превод од mRNA. ПТМ може да извршува различни функции, вклучувајќи сигнализација на протеини, регулирање на генската експресија или предизвикување оксидативна штета. Електрофорезата со 2Д гел е чувствителна на промени како што се метилација или ацетилација, што може да предизвика промена на pI и молекуларна тежина.
Само што го гледавте видеото на JoVE на електрофореза со 2Д гел. Ова видео ги опиша принципите на техниката, типична експериментална постапка и некои од нејзините апликации во биомедицинското поле.